5個山東地方雞種及培育品系（種）中綠殼蛋基因型檢測

周艷　雷秋霞　韓海霞　李福偉　高金波　劉瑋　劉杰　曹頂國

摘要：為了檢測山東省地方雞種及其培育品系（種）中綠殼蛋基因的分布情況，本研究設計了多重PCR引物對部分山東地方雞種及綠殼蛋雞專門化品系進行基因型鑒定。結果表明：汶上蘆花雞綠殼系公雞、母雞中的綠殼基因型頻率（ LS/LS）分別為0.9667和1.0000;某綠殼蛋雞專門化品系中綠殼基因純合型（LS/LS）個體比例只有7.69%，雜合型（LS/NN）比例高達92.31%;在瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞中均未檢測到綠殼基因型。本檢測結果與各供試群體的遺傳背景相符，說明本檢測方法準確。

關鍵詞：綠殼蛋基因;分子檢測;山東地方雞種;綠殼系

Genotype Detection of Blue - Shelled Eggs in FiveShandong Local Chicken Breeds and Breeding Lines （ Species）Zhou Yan， Lei Qiuxia， Han Haixia， Li Fuwei， Gao Jingbo， Liu Wei， Liu Jie， Cao Dingguo

Abstract To investigate the distribution of blue - shelled gene in Shandong local chicken breeds andbreeding lines （species） ， multiplex PCR primers were set to detect the genotypes of some Shandong localchicken breeds and blue - shelled laying hens. The results showed that the frequencies of blue - shelled geno-type （ LS/LS） in roosters and hens of Wenshang barred chicken were 0.9667 and l.0000， respectively. Thefrequency of blue - shelled gene （ LS/LS） in the special blue - shelled strain was only 7. 69% ， but the heter-ozygous （ LS/NN） frequency was 92.31%. The blue - shelled genotype did not found in Langya chicken，Wenshang barred chicken and Luqin chicken. The results were consistent with the genetic background of thetested populations， which indicated that the method built in this research was accurate and fast.

Keywords Blue - shelled gene; Molecular detection; Shandong local chicken breeds; Blue - shelledstrain

雞蛋殼顏色是重要的經濟性狀，近年來，綠殼蛋因其顏色符合當前人們追求健康的需求，因而受到廣泛歡迎。綠殼蛋雞是稀有雞種，我國只有東鄉綠殼蛋雞、長順綠殼蛋雞等幾個地方雞種產綠殼蛋，而且產蛋量不高。為迎合市場需求，國內育種企業通過與高產蛋雞雜交的方式培育綠殼蛋雞專門化品系進行商業化生產。但在實際生產中，由于公雞和雜合型母雞均不能通過表型檢測其基因型，導致綠殼蛋雞純系的獲得較為困難，而常規的測交鑒定和純系選育等方式不但周期長，而且人力物力浪費巨大。分子生物學的發展給家禽育種提供了更多途徑，通過分子標記鑒定綠殼蛋基因型不但準確率高、極大地節約成本，而且能加快育種進程、推進育種進展。

Punnett[1]認為雞蛋的綠殼性狀是1號染色體上顯性綠殼基因（OocVan，O）作用的結果。Bitgood等[2]將雞的綠殼基因（O）定位于1號染色體短臂上。Bartlett等[3]發現綠殼基因與內源病毒因子（evl）及豆冠位點（P）連鎖。Bitgood等[4]進一步驗證了Bartlett等的結論，證明O-P的連鎖，并將其定位在GGA1的短臂上。王哲鵬等[5]研究表明雞綠殼蛋表型是由OATP基因大片段插入引起。Wang[6]和Wragg等[7]均進一步揭示雞蛋綠殼性狀的分子機制是由有機陰離子轉運多肽IB3基因（solute carier organic anion trans-porter familv member IB3，SLCOIB3，位于1號染色體65 319 441～65 338 450 bp）的5側翼區插入鳥類逆轉錄酶病毒（EAV - HP，長度約為4.2kb）所造成。當EAV - HP插入到SLC01 83的5側翼區后，導致SLCOIB3基因在子宮部特異表達，從而使蛋殼顏色表現為綠殼。針對這一原理，本研究設計多重PCR引物對部分山東地方雞種及綠殼蛋雞專門化品系進行綠殼蛋基因型鑒定，以期為山東地方雞種創新利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞均取自山東省地方雞品種資源活體基因庫，汶上蘆花雞綠殼系取自山東龍盛農牧集團，某綠殼蛋雞專門化品系來自山東省某育種企業。238只待測個體均為隨機取樣，翅下靜脈采血約l mL，ACD抗凝，常規酚/氯仿提取基因組DNA，- 20 ℃保存備用。

1.2 主要試劑

2×Taq PCR MasterMix、Marker I購自天根生化科技（北京）有限公司，瓊脂糖、蛋白酶K、Tris飽和酚以及常規耗材購自濟南金博生物科技有限公司。

1.3 引物設計

根據已發表的SLCOIB3（GeneBank accessionnumber：JN020139.1）和EAV - HP（GenBank ac-cession number： JF837512）序列，設計1條上游引物F和2條下游引物R1和R2（F：5'-TGAC-CAGCGTAGATAAACAT-3; R1：5- TCAGAAAGACCCATAGAAAT-3 ;R2：5 '-AACACGTAGCCTAT-AGCAA T-3），擴增片段長度為223 bp和397 bp。

1.4 待測個體基因型檢測

多重PCR擴增體系（25μL）：2×Taq PCRMasterMix 12.5μL、ddH2O 8.5μL、F引物（10pmol/μL）1.OμL， R1引物（10 pmol/μL）1.0μL，R2引物（10 pmol/μL）1OμL，模板DNA（50ng/μL）1.0μL。

PCR擴增程序：95℃ 3 min;95℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 20 s，共36個循環;72℃5 min，4℃保存。

PCR產物檢測：120V、1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統拍照保存用于后續基因型判定。

1.5 基因型判定

PCR產物只檢出片段長度為397 bp的單一目的條帶，表明該個體基因型為NN/NN（非綠殼純合型）;PCR產物只擴增出片段長度為223 bp的單一目的條帶，表明該個體基因型為LS/LS（綠殼純合型）;PCR產物擴增出223 bp和397 bp兩條目的條帶，表明該個體基因型為LS/NN（綠殼雜合型）。

2 結果與分析

2.1 多重PCR檢測結果

由圖1可知，該引物組合擴增出的目的片段符合預期，且條帶單一，邊緣清楚，無非特異條帶干擾，雜合子中的兩條帶能夠清楚分離。分別選取綠殼純合型（ LS/LS）和非綠殼純合型（NN/NN）各2個純合個體送濟南力戈科技有限公司測

2.2 供試群體綠殼基因型檢測結果

由表2可知，汶上蘆花雞綠殼系公雞30個個體中有29個為綠殼純合型，占96.67%，綠殼等位基因LS頻率為0.9833;28個母雞個體均為綠殼純合型，綠殼等位基因LS頻率為1.0000。某綠殼蛋雞專門化品系13個母雞個體中綠殼純合型只有1個，綠殼基因雜合型比例達92.31%。在瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞的公、母雞中均未檢測到綠殼基因型，非綠殼純合型比例為100%。

3 討論與結論

選用的5個供試群體中，包含2個山東地方雞種、2個專門化品系和1個培育品種，共238個待檢個體的基因型判定結果符合預期，其中在瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞中均未發現有綠殼蛋基因型，汶上蘆花雞綠殼系中的綠殼蛋基因純合型比例較高，在58個供試個體中僅檢出1例雜合序，BioEdit軟件比對結果表明測序結果與原設計序列相符。基因型。而某綠殼蛋雞專門化品系中雜合型比例高達92.31%，因此在后續選育過程中需要加大提純力度。檢測結果表明設計的多重PCR引物組合適應性強、準確率高，無論在地方雞種、專門化品系還是培育品種中均能準確區分、鑒定綠殼蛋純合型、雜合型以及非綠殼蛋純合型個體。

雖然分子生物學手段大大提高了綠殼蛋基因選擇的準確率、縮短選擇時間、加快育種進程[8]，但綠殼性狀是由多基因控制的表型性狀[9]，單一分子標記不能完全解決這一問題。為了充分挖掘利用這些為數不多的寶貴遺傳資源[10]，隨著分子生物學技術的發展，應該繼續研究其分子機理，全面揭示其遺傳機制，以期將這一重要經濟性狀更好地應用于生產實際。

參考文獻：

[1] Punnett R C. Genetic study in poultry ： IX. The blue egg[J] .Journal of Cenetics. 1933 . 27 ： 465 - 470.

[2] Bitgood J J. Shoffner R N. Otis J S， et al. Mapping of thegenes for pea comb. blue egg， barring， silver. and bloodgroups A， E， H， and P in the domestic fmvI[J] . Poultry Sci-ence. 1980. 59（ 8） ： 1686 - 1693.

[3] Bartlett J R. Jones C P， Smith E J. Linkage analysis of endog-enous viral eleruent l. blue eggshell， and pea comb loci inchiickens[J] . The Joumal of Heredity， 1996 ， 87 （1） ： 67 -70.

[4] Bitgood J J. Briles R W. Briles W E. Further tests for geneticlinkages of three morphological traits， three blood groups， andbreak points of hvo chromosome translocations on chromosomeone in the chicken [J] . Poultry Science ， 2000 . 79 （3） ： 293 -295.

[5] 王哲鵬，鄧學梅，吳常信.雞綠殼蛋表型由OATP基因大片段插入引起[C]//安全優質的家禽生產第十五次全國家禽學術討論會論文集.廣州：華南理工大學出版社，2011：18 - 20.

[6] Wang Z，Qu L，Yao J，et al. An EAV- HP insertion in 5flanking region of .SLCOIB3 causes blue eggshell in the chicken[J]. PLoS Genetics， 2013，9（1）：e1003183.

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[8] 張吳，申杰，吳艷，等.雞綠殼蛋基因分子鑒定方法在湖北地方雞育種群體中的檢測應用[J].中國家禽，2016，38（12）：66 -68.

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[10] 王晨，張丹萍，張浩，等.5個綠殼蛋雞群體中EAV - HP在.SLCOIB3基因5一非編碼區插入整合頻率和類型的研究[J].中國畜牧獸醫，2014，41（10）：183 -188.