腸道微生物在自身免疫性肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用

池肇春

山東省青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)科 (山東 青島， 266011)

自身免疫性肝炎(AIH)是一種異常免疫反應(yīng)介導(dǎo)的針對(duì)肝細(xì)胞的肝內(nèi)炎癥性疾病。AIH以不同程度的血清轉(zhuǎn)氨酶升高、高γ-球蛋白血癥、血清特征性自身抗體陽(yáng)性、肝組織學(xué)特征性改變和對(duì)免疫抑制治療應(yīng)答為特征。發(fā)病機(jī)制可能是免疫耐受、遺傳易感性和環(huán)境條件改變的結(jié)果，這些因素共同誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)肝抗原的攻擊，導(dǎo)致壞死性炎癥和肝損傷[1]。

AIH可以發(fā)生于世界范圍內(nèi)任何地區(qū)和種族，多見(jiàn)于女性，男女比例約為1∶4。患病率因地理區(qū)域而異。AIH是一種嚴(yán)重的進(jìn)行性疾病，約40%未經(jīng)治療的患者在診斷AIH后6個(gè)月內(nèi)死亡。經(jīng)免疫抑制劑治療后，80%～90%的患者可獲得臨床和生物化學(xué)緩解，獲得臨床緩解的患者預(yù)期壽命與健康人群無(wú)差別[2]。AIH患者10年總體生存率為82%～95%，20年總體生存率約為48%。

AIH患者與健康志愿者相比，結(jié)合腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白(小帶閉塞蛋白-1和閉塞蛋白)減少，血漿LPS水平升高，腸厭氧菌(雙歧桿菌和乳酸桿菌)減少，這些發(fā)現(xiàn)支持了AIH與生物功能障礙、胃腸黏膜屏障通透性增加以及腸道來(lái)源的微生物產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到全身循環(huán)中相關(guān)。

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，腸道微生物可通過(guò)激活TLR和促進(jìn)肝臟內(nèi)炎癥小體的形成影響全身免疫應(yīng)答。由抗生素、遺傳因素或疾病(生物障礙)引起的腸道微生物組成的改變可通過(guò)克服或逃避對(duì)共生細(xì)菌的正常耐受性反應(yīng)來(lái)維持或增強(qiáng)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。細(xì)菌成分可充當(dāng)抗原，刺激全身免疫應(yīng)答或腸內(nèi)原代免疫細(xì)胞，隨后進(jìn)入外周淋巴組織。腸道微生物群在肝病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，其標(biāo)志性事件是生物失調(diào)，或病理障礙和有益細(xì)菌的失衡，對(duì)宿主有相關(guān)的有害影響[3]。

1 腸-肝軸與AIH

腸-肝軸是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，涉及多種成分——腸道屏障、腸道微生物、膽汁、共享淋巴細(xì)胞歸巢，以及幾種肝受體，如PRR或法尼索X受體(FXR,法尼酯衍生物受體)、G-蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(TGR5)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4(FGFR4)，它們將代謝途徑與炎癥聯(lián)系起來(lái)。腸-肝軸的調(diào)節(jié)失調(diào)或損傷可激活肝臟先天免疫應(yīng)答，導(dǎo)致誘導(dǎo)肝損傷，或促進(jìn)肝損傷的進(jìn)展[4]。

各種研究表明，腸-肝軸在多種類(lèi)型肝病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。然而，目前還沒(méi)有對(duì)AIH患者腸道屏障功能和微生物學(xué)變化的研究。有研究發(fā)現(xiàn)AIH與腸漏和腸道微生物異常有關(guān)。有證據(jù)表明，腸屏障受損可導(dǎo)致細(xì)菌及其產(chǎn)物如脂多糖(LPS)和含有DNA的未甲基化CpG進(jìn)入肝臟。這些腸源性毒素可能通過(guò)先天免疫系統(tǒng)的異常激活打破肝臟的穩(wěn)態(tài)，觸發(fā)與肝臟炎癥有關(guān)的信號(hào)通路，導(dǎo)致AIH發(fā)生[5，6]。

2 腸道微生物與腸道屏障及細(xì)菌易位

AIH患者腸道緊密連接的完整性受損。AIH時(shí)十二指腸絨毛較小，排列不規(guī)則，緊密連接中斷。固有層可見(jiàn)炎性細(xì)胞。AIH患者血清中小帶閉塞蛋白-1(ZO-1)和閉塞蛋白表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯降低。ZO-1、閉塞蛋白表達(dá)降低與病情進(jìn)展密切相關(guān)(P<0.05)。

與健康對(duì)照組相比，AIH患者厭氧菌數(shù)量減少(以雙歧桿菌和乳酸桿菌為主)，而需氧菌數(shù)量(以大腸桿菌和腸球菌為主)無(wú)明顯變化。表明腸道菌群平衡的雙歧桿菌/大腸桿菌(B/E)減少(P<0.05)。結(jié)果表明，AIH患者存在腸道菌群失調(diào)，而健康對(duì)照組則沒(méi)有，提示AIH患者有腸道緊密連接的完整性受損。此外，還發(fā)現(xiàn)LPS水平升高與疾病晚期密切相關(guān)(P<0.05)。這些結(jié)果表明AIH患者可能存在細(xì)菌易位[7]。

當(dāng)腸屏障受損時(shí)(如腸通透性增加或腸免疫失調(diào)期間)，具有強(qiáng)免疫激活特性的食物抗原和細(xì)菌抗原, 例如LPS、肽聚糖、超抗原、細(xì)菌DNA、鞭毛蛋白和熱休克蛋白可以穿過(guò)腸上皮。在健康條件下氦的數(shù)量更多，它可以刺激腸相關(guān)淋巴組織(GALT)釋放促炎細(xì)胞因子(TNF、IL-1、IL-6等)、趨化因子和二十碳六烯。GALT不能消除抗原的負(fù)荷，而腸道炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)菌代謝產(chǎn)物, 如乙醇、乙醛、三甲胺、短鏈脂肪酸(SCFAs)和游離脂肪酸通過(guò)門(mén)靜脈一起被輸送到肝臟。在肝臟中，這些成分的大量流入激活肝臟免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)肝臟損傷、炎癥和纖維形成。在慢性肝病的病理生理和進(jìn)展中，發(fā)現(xiàn)腸通透性增加以及血漿炎癥細(xì)胞因子水平增加。類(lèi)似的，在門(mén)靜脈和/或體循環(huán)內(nèi)毒素血癥中，在一些慢性肝病中細(xì)菌LPS水平增加[5，6]。

研究發(fā)現(xiàn)，醇溶蛋白(Prolamin)本身通過(guò)釋放小腸TJs的調(diào)節(jié)因子小帶閉塞蛋白來(lái)增加腸通透性[5,8]。腔內(nèi)醇溶蛋白與腸上皮細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體CXCR3結(jié)合，誘導(dǎo)MyD88依賴(lài)的小帶閉塞蛋白釋放，導(dǎo)致腸細(xì)胞TJs開(kāi)放。CXCR3在炎癥性腸病患者中過(guò)表達(dá)，與醇溶蛋白共定位。CXCR3主要表達(dá)在免疫細(xì)胞上，但是它也在非免疫細(xì)胞上表達(dá)，包括肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在正常肝臟和受傷肝臟中，駐留的肝免疫細(xì)胞和肝細(xì)胞都表達(dá)CXCR3。雖然這些受體在穩(wěn)態(tài)肝環(huán)境中的作用尚不清楚，但在損傷期間，它們參與細(xì)胞存活、活化、增殖、凋亡、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化、血管生成以及增加趨化因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)[9]。最近，利用包括人肝(肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞)和腸(腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)模型的集成多器官平臺(tái)，證實(shí)了炎癥性腸-肝相互作用下呈現(xiàn)CXCR3配體的上調(diào)[10]。

細(xì)菌易位是指活的內(nèi)源性細(xì)菌或其產(chǎn)物，如LPS和細(xì)菌DNA，從腸道傳遞到腸系膜淋巴結(jié)、體循環(huán)和腸外器官。LPS是由革蘭氏陰性菌衍生而來(lái)的外膜分子。LPS作為細(xì)菌易位的標(biāo)志物，是免疫反應(yīng)的強(qiáng)效激活劑，可引起肝臟損傷[11]。研究證明AIH患者血漿LPS水平升高，并且升高的程度與疾病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。

通過(guò)研究推測(cè)腸漏和微生物菌群失活可能與AIH的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。腸微生物群的改變和腸屏障的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)菌易位和門(mén)靜脈內(nèi)毒素血癥，并增加肝臟暴露于腸源性細(xì)菌產(chǎn)物之中，包括LPS和未甲基化的CpG DNA。這些產(chǎn)物破壞肝臟免疫耐受，異常地激活先天免疫受體，即Toll樣受體，其可能觸發(fā)“有害炎癥”，導(dǎo)致肝臟炎癥和組織破壞。因此，可以認(rèn)為腸屏障功能受損可能是AIH自身免疫攻擊開(kāi)始的一部分。

綜上所述，研究結(jié)果證明AIH與受損的腸屏障和微生物失活相關(guān)，并且這些變化與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，AIH中“滲漏”腸伴緊密連接斷裂的證據(jù)存在可能導(dǎo)致微生物的紊亂。這些觀察對(duì)于理解AIH中腸-肝軸與自身免疫反應(yīng)之間的聯(lián)系有重要意義。因此，恢復(fù)腸屏障完整性可能是AIH患者的潛在治療靶點(diǎn)。

3 膽汁酸合成失調(diào)與AIH

患有代謝性疾病、自身免疫性肝炎和肝硬化或癌癥的患者中發(fā)現(xiàn)膽汁酸(BA)合成失調(diào)或法尼酯衍生物X受體(FXR)水平降低[12]。現(xiàn)已證實(shí)，BA合成失調(diào)與代謝性疾病、AIH、肝硬化和肝癌的發(fā)生有關(guān)[13～15]。新的研究發(fā)現(xiàn)FXR KO小鼠產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌減少，而西方飲食(WD)的攝入量進(jìn)一步減少丁酸的產(chǎn)生。

BA是由肝酶和細(xì)菌酶共同產(chǎn)生的。除了產(chǎn)生游離和共軛的初級(jí)BA的肝酶之外，在雙歧桿菌和乳酸桿菌中發(fā)現(xiàn)的膽鹽水解酶使BA解偶聯(lián)，而來(lái)自硬壁菌門(mén)的7α-脫羥酶將初級(jí)BA轉(zhuǎn)化為次級(jí)BAs。因此，BA不僅僅是負(fù)責(zé)脂質(zhì)吸收和代謝的洗滌劑，還是細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物，在調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)和免疫方面具有關(guān)鍵作用[16，17]。然而，BA與細(xì)菌代謝物之間的相互作用還有待研究。

Sheng等[12]研究首次發(fā)現(xiàn)丁酸生成菌的減少以及SCFA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與FXR和WD攝入所致肝炎的失活有關(guān)。使用缺乏產(chǎn)生丁酸細(xì)菌的糞便進(jìn)行微生物移植會(huì)增加肝臟炎癥。此外，丁酸鹽的攝入消除了由FXR失活相關(guān)的BA合成失調(diào)引起的肝臟炎癥。BA失調(diào)在肝臟疾病中的作用已經(jīng)被揭示。最新報(bào)告數(shù)據(jù)表明，丁酸可以逆轉(zhuǎn)由WD攝取和FXR失活引起的BA產(chǎn)生的一些最顯著的變化及其相關(guān)的病理改變，即肝臟炎癥。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明了丁酸鹽以及產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌在維持肝臟健康方面的重要性，這在以前尚未得到證實(shí)。

3.1 丁酸在肝臟中的潛在作用 丁酸酯存在于諸如家庭奶酪之類(lèi)的飲食產(chǎn)品中。此外，丁酸和其他SCFA是通過(guò)腸內(nèi)消化纖維發(fā)酵產(chǎn)生的。在乙酸、丁酸和丙酸中，丁酸提供結(jié)腸細(xì)胞所需的60%～70%的能量，而丁酸在維持腸上皮完整性中起關(guān)鍵作用[18]。丁酸鹽連同乙酸和丙酸鹽，可以從腸道轉(zhuǎn)移并被肝臟利用。丁酸可被肝細(xì)胞直接代謝[19]。因此，丁酸對(duì)肝臟炎癥和代謝信號(hào)的影響可以直接改善腸道健康。也有可能增加丁酸可以改變乙酸和丙酸的濃度，這反過(guò)來(lái)影響肝臟健康。這些可能性值得進(jìn)一步研究。

在3種SCFA的受體中，羥基羧酸受體2(HCAR2)是丁酸和煙酸特異性的。游離脂肪酸受體3(FFAR3)優(yōu)先被丙酸活化，其次是丁酸和乙酸，而FFAR2可以被所有3個(gè)SCFA活化。最新研究顯示，在WD喂養(yǎng)的FXR KO小鼠肝臟和腸道中，3種SCFA受體的表達(dá)均降低，表明BA合成失調(diào)與SCFA信號(hào)傳導(dǎo)之間存在交互作用。此外，丁酸攝入增加所有3個(gè)SCFA受體基因在腸道中的表達(dá)，這與減少腸道和肝臟的炎癥有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示丁酸能夠增加乙酸和丙酸信號(hào)傳導(dǎo)。

丁酸的抗炎作用部分歸功于它能夠增加緊密連接蛋白的表達(dá)，防止引起腸漏。其有益效果也可歸因于增加新陳代謝，從而減少氧化應(yīng)激。此外，丁酸具有組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制特性，通過(guò)表觀遺傳機(jī)制減少炎癥。丁酸還通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)失活在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞或皮膚組織中具有抗炎作用[20]。丁酸可以激活有絲分裂原激活蛋白激酶(p38)，這可能有助于提高過(guò)氧化物酶體增殖物激活(PPA)協(xié)同刺激因子-1α(PGC-1α)的活性[21]。數(shù)據(jù)顯示丁酸的攝入量增加了總p38 MAPK和激活p38 MAPK。BA合成失調(diào)可能導(dǎo)致肝臟p38 MAPK失活。

3.2 BA合成失調(diào)與肝臟疾病 肝臟總BA由于WD攝入和FXR缺乏而增加。然而，丁酸缺乏的糞菌移植增加了肝臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，沒(méi)有進(jìn)一步增加肝臟總BA，表明個(gè)體不是因總BA增加而引起肝臟炎癥的。FXR失活相關(guān)肝腫瘤的發(fā)生可以通過(guò)使用膽固醇消減BAs來(lái)預(yù)防。目前的研究顯示丁酸能夠改變個(gè)體BA水平，如脫氧膽酸 (DCA)，這可能是預(yù)防肝腫瘤發(fā)生的現(xiàn)實(shí)途徑。

在肥胖個(gè)體中發(fā)現(xiàn)高濃度的糞便DCA。DCA誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的衰老相關(guān)分泌表型，其分泌炎癥和增殖因子[22]。此外，DCA通過(guò)誘導(dǎo)核NUR77，又稱(chēng)為神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的基因B(NGFI-B)具有增殖特性[23]。然而，異去氧膽酸(HDAC)抑制劑可誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)NUR77表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。由于丁酸的HDAC抑制作用，丁酸可能增加胞漿NUR77，并具有抗腫瘤作用。丁酸在諸如AIH、原發(fā)性膽管炎和原發(fā)性硬化性膽管炎等BA合成失調(diào)中的作用有待進(jìn)一步研究。

WD攝入量和FXR缺乏均可增加肝臟鼠膽酸(β-MCA)，WD喂養(yǎng)的FXR KO雄性小鼠的β-MCA含量最高。補(bǔ)充丁酸可降低WD喂養(yǎng)FXR KO小鼠β-MCA含量的增加。此外，研究顯示肝臟β-鼠膽酸(β-MCA)增加與血清LPS水平呈正相關(guān)，但與丁酸濃度呈負(fù)相關(guān)。值得注意的是，β-MCA可以在人尿液中檢測(cè)到。丁酸對(duì)肝臟β-MCA的調(diào)節(jié)機(jī)制及β-MCA的病理生理作用值得進(jìn)一步研究。

總之，調(diào)節(jié)失調(diào)的BA合成相關(guān)肝炎伴隨產(chǎn)生丁酸細(xì)菌的減少和SCFA信號(hào)的減少，通過(guò)補(bǔ)充丁酸可以得到逆轉(zhuǎn)。所有這些變化都與BA譜的變化以及產(chǎn)生BA的細(xì)菌豐度有關(guān)。因此，產(chǎn)生丁酸和BA的細(xì)菌很可能會(huì)影響彼此的生長(zhǎng)和擴(kuò)展。飲食干預(yù)以及益生菌的攝入可能被用于治療和預(yù)防肝病[24]。

3.3 T濾泡輔助細(xì)胞與AIH T濾泡輔助(Tfh)細(xì)胞代表不同的CD4+輔助T細(xì)胞亞群，專(zhuān)門(mén)為B細(xì)胞提供幫助。它們?cè)诖渭?jí)淋巴器官(SLO)中發(fā)育，并且可以根據(jù)其獨(dú)特的表面表型、細(xì)胞因子分泌譜和特征轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定。它們支持B細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)抗原(Ag)的高親和力抗體，以形成強(qiáng)健的體液免疫應(yīng)答，它們對(duì)B細(xì)胞記憶的產(chǎn)生至關(guān)重要[25]。

AIH可表現(xiàn)為從無(wú)癥狀、輕度慢性肝炎到急性發(fā)作的暴發(fā)性肝衰竭的各種表現(xiàn)。對(duì)AIH小鼠模型的研究表明，脾臟中調(diào)節(jié)失調(diào)的Tfh細(xì)胞是誘發(fā)致命AIH的原因，從而提出了Tfh細(xì)胞在該病中可能的關(guān)鍵作用。與人類(lèi)相比，AIH患者活化的cTfh細(xì)胞(PD-1+或ICOS+Tfh細(xì)胞)的百分比增加。活化的cTfh細(xì)胞頻率與血清IgG水平呈正相關(guān)，與血清白蛋白和血清凝血酶原時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[26]。隨著血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶的降低，這種人群在強(qiáng)的松龍治療之前顯著減少。AIH患者血清IL-21水平高于其他肝病患者或健康志愿者，此與cTfh細(xì)胞數(shù)量高低相關(guān)，與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，與總膽紅素水平呈正相關(guān)，與血清白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。從AIH患者的肝活檢中提取的細(xì)胞的免疫組織化學(xué)研究和流式細(xì)胞術(shù)獲得的數(shù)據(jù)也已經(jīng)發(fā)表，患者肝臟中活化的Tfh細(xì)胞的頻率顯著增加，并且與患者血液中的循環(huán)對(duì)等物呈正相關(guān)[26]。血清IL-21水平與壞死炎癥活性分級(jí)呈正相關(guān)[27]。