濕熱蘊結型自身免疫性肝炎的代謝標志物篩選及中西醫治療研究*

馬光朝 胡 棣 浦仕彪

云南中醫藥大學中藥學院 (云南 昆明， 650500)

自身免疫性肝炎(AIH)是自身免疫性肝病(AILD)中較為常見的一型疾病，是一種病因和發病機制尚未明確，由異常自身免疫反應介導的嚴重的進行性疾病。流行病學研究顯示，AIH病情反復發作，遷延不愈，發病率逐年升高[1, 2]。免疫抑制劑為AIH的首選治療藥物，潑尼松(龍)單一治療或加用硫唑嘌呤聯合治療被公認為是AIH的基礎治療，并被臨床廣泛應用，但長期應用不良反應明顯，且停藥后復發率較高，不能滿足AIH臨床治療的需要[3～6]。大部分臨床報道提示中醫及中西醫結合治療AIH具有療效顯著、不良反應少的特點，充分應用中西醫結合療法，使其優勢互補是當前臨床研究的熱點和主要趨勢。針對AIH診斷血清抗體缺乏特異性、不能預示疾病預后的問題，前期課題組通過臨床研究發現代謝標志物可以較好地預測疾病的預后[7]。因此，本課題旨在篩選濕熱蘊結型自身免疫性肝炎的代謝標志物，加強AIH的中醫證候學研究，以期形成病-證-藥一體化的中西醫結合治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2018年12月在我校門診部治療的AIH患者44例，女42例，男2例。將42例女性患者隨機分成對照組和治療組，各21例；2例男性患者分別入對照組和治療組，各1例。兩組分別給予糖皮質激素和糖皮質激素聯合中藥治療。另入選健康人群23例，男1例，女22例。見表1。

表1 臨床特征在研究對象間的比較

1.2 診斷標準 濕熱蘊結型AIH患者的診斷參照國際自身免疫性肝炎小組1998年修訂的《AIH診斷及評分標準》和《2010美國肝病學會自身免疫性肝炎診治指南》[8，9]。中醫辨證、癥狀評分參照《中醫內科學》、《中醫診斷學》及《中藥新藥臨床研究指導原則》[10～12]。

1.3 納入和排除標準 納入標準：年齡18～70歲，診斷均符合上述標準，樣品采集前未經特異性治療，簽署知情同意書，自愿參加本項研究。排除標準：合并病毒感染性疾病、藥物性肝炎、酒精性肝病等疾病；合并嚴重的心腦血管、肝、腎、消化、造血系統等疾病；合并感染及出血者；進展性惡性腫瘤或其他嚴重消耗性疾病；意識不清、不能表達主觀不適癥狀以及精神病患者。

1.4 治療方法 對照組：潑尼松片口服，首次60 mg/d，每服藥7 d遞減劑量，直至每日20 mg，固定劑量服用，持續服用藥物3個月。治療組：在對照組的基礎上，同時服用中藥(茵陳、虎杖、赤芍、柴胡、青皮、木香、白術、敗醬草、云苓、麥芽)，1劑/d，水煎至200 ml，2次/d，早晚服用。

1.5 觀察指標 觀察治療前后AIH患者的肝功能、免疫學指標、代謝標志物、中醫癥狀積分及臨床療效。療效判定標準參照《2010美囯肝病學會自身免疫性肝炎指南》和《中藥新藥臨床研究指導原則》。

1.6 儀器與試劑 600 MHz超導核磁共振譜儀 (INOVA，美國瓦里安公司)；冷凍離心機(德國Sigma公司)；重水(D2O, 99.9%，德國Merek公司)；3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉(TSP，德國Merck公司)。

1.7 臨床樣本的處理 將血漿樣本從-80 ℃冰箱取出，4℃復融，吸取200 μl置于EP管中，加入400 μl D2O與之混合，12 000 轉/min 4℃離心10 min，取550 μl上清加入5 mm核磁管內，即為備用樣品。

1.81H NMR檢測 運用馳豫編輯脈沖序列(CPMG)采集血漿樣本數據，觀測血漿中的小分子代謝物。測定溫度設定為25℃，譜寬為8 000 Hz，采樣點數64 k，采樣時間2 s，掃描次數128次，2 nτ為320 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。對自由感應衰減(FID)信號數據進行填零，加上1Hz的線增寬因子后進行傅立葉變換轉得到1H NMR譜圖，以乳酸甲基信號雙峰的左側峰定為δ1.33。

2 結果

2.1 代謝生物標志物篩選 健康組志愿者與AIH患者血漿1H NMR譜圖的PLS-DA分析結果空間分布見圖1。模型質量參數R2X=23.2%，R2Y=91.7%，表明擬合模型的準確度及預測度均良好。選擇具有顯著性差異(P<0.05)且VIP>1，|P(corr)|>0.58對應的代謝生物標志物為濕熱蘊結型AIH患者血漿代謝標志物。見表2。

表2 濕熱蘊結型AIH患者血漿代謝標志物

圖1 AIH患者與健康志愿者PLS-DA得分圖

▲ AIH患者

■健康志愿者

2.2 生物標志物對中西醫干預效應 本研究采用治療前后代謝標志物的峰面積變化趨勢來反映標志物對中西醫干預效應。結果顯示，兩種治療方法對濕熱蘊結型AIH代謝標志物均具有調節作用，其中對丙氨酸、組氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸呈上調趨勢。對檸檬酸、β-羥丁酸、牛磺酸、乳酸、肌酸、乙酰乙酸、α-葡萄糖呈下調趨勢，對谷酰胺、膽堿調節作用不明顯。見表3。

表3 代謝標志物的調節作用在兩種治療方法間的比較

2.3 兩組患者臨床療效 3個療程后，治療組顯效19例(86.36%)，有效3例(13.64%)，無效0例，顯效率為86.36%，總有效率為100%；對照組顯效13例(59.09%)，有效7例(31.82%)，無效2例(9.09%)，顯效率為59.09%，總有效率為90.91%。

2.4 中醫癥候積分判斷療效情況 按照中醫證候積分，判定臨床痊愈、顯效、有效、無效4項等級，以判定治療效果。治療組顯效19例(86.36%)，有效3例(13.64%)，無效0例，顯效率為86.36%，總有效率為100%；對照組顯效3例(13.64%)，有效6例(27.27%)，無效9例(40.91%)，顯效率為13.64%，總有效率為59.09%。

2.5 兩組患者治療前后肝功能檢測結果 見表4。

表4 治療前后兩組患者肝功能比較

2.6 兩組患者治療前后免疫球蛋白檢測結果 見表5。

表5 兩組患者治療前后免疫球蛋白比較

3 討論

AIH是嚴重的進行性疾病，目前研究熱點主要集中于自身抗體、遺傳及組織學等領域。自身抗體，如抗核抗體、抗平滑肌抗體的檢測對于AIH的診斷有重要意義，是診斷的必要條件之一。但是多數自身抗體既無種屬或器官特異性，也無疾病特異性，不能預示疾病的預后，不少學者認為不宜將自身抗體絕對水平及其變化作為判斷疾病嚴重程度或治療效果的指標。從病與證的內涵看，病是決定證的內在穩定因素，而證是病的外在綜合表現，證可隨著疾病的進退而變化，本研究結果也從濕熱蘊結型證相關代謝標志物的變化情況佐證了證可隨著疾病的進退而變化，代謝標志物對AIH的預后及治療效果有一定的預示作用。乙酰乙酸、β-羥異丁酸含量與疾病的嚴重程度有一定的關系，從體內代謝途徑來看，二者含量的升高預示著肝細胞的損害嚴重以及機體能量代謝的異常。谷酰胺是體內最豐富的游離氨基酸之一，是重要的促免疫氨基酸，有重要的免疫調節作用，是淋巴細胞分泌、增殖及其功能維持所必需的，其濃度升高可能提示AIH患者免疫功能紊亂。肌酸含量水平與疾病的嚴重程度有一定的關系，被認為是評估肝臟損傷的一個非常靈敏的指標。組氨酸含量與疾病的嚴重程度有一定的關系，檸檬酸是三羧酸循環的一系列反應中的關鍵化合物，其含量水平的升高可能提示AIH患者機體三羧酸循環紊亂亢進，并預示患者線粒體功能的紊亂。膽堿是細胞膜重要組成成分，肝硬化患者膽堿含量減少說明肝細胞再生活躍，這可能與肝纖維化形成有關。

對于AIH的治療，中醫或中西醫結合療法在提高臨床療效、減輕不良反應以及提高生活質量等方面都有積極作用。中醫學對AIH的證候、病因、病機認識尚未達成共識，對AIH的治療亦未形成統一標準。因此，本課題旨在篩選濕熱蘊結型AIH的代謝標志物，加強對AIH的中醫證候學研究。對于濕熱蘊結型AIH的中醫治療，研究主要采用利濕逐瘀、疏肝健脾的治療方法，以通利肝膽、大腸之機，祛除濕邪瘀滯。從治療后臨床療效觀察來看，該組方對濕熱蘊結型AIH的治療具有積極作用。