基于電噴霧-四極桿-飛行時間質譜的高聚合度人乳寡糖異構體結構解析

李欣 李佳齊 金高娃 于龍 郭志謀 梁鑫淼 劉帥 閆競宇

摘?要?人乳寡糖是一類存在于人乳中的天然益生元，在促進嬰兒腸道菌群生長、完善免疫系統功能和抵抗病原體侵染過程中發揮著不可替代的作用。人乳寡糖的功能與其結構密切相關，但其結構組成復雜、連接方式多樣，存在大量的同分異構體，且隨著寡糖聚合度的升高，同分異構體的數目和復雜性都急劇增加。因此，高聚合度的寡糖異構體的結構解析是人乳寡糖研究的難點之一，對寡糖的生物功能研究具有重要意義。本研究采用電噴霧-四極桿-飛行時間質譜（ESI-Q/TOF-MS）， 在負離子模式下對分離獲得的18個高聚合度人乳寡糖（其中3個為首次報道）進行了結構解析，探討了同組異構體之間碎片離子的差異，并詳細總結了寡糖異構體的裂解規律，為復雜的高聚合度人乳寡糖異構體的結構解析及新型糖結構的發現提供了科學依據。

關鍵詞?人乳寡糖; 同分異構體; 結構解析; 電噴霧-四極桿-飛行時間質譜

1?引 言

人乳寡糖（Human milk oligosaccharides，HMOs）是人乳干物質中僅次于乳糖和脂肪，含量第三的成分，結構復雜，種類繁多，功能豐富[1～6]。研究表明，人乳寡糖在嬰幼兒生長發育中起到了重要作用，主要包括：（1）促進腸道雙歧桿菌等有益菌的生長; （2）可以模擬并替代宿主上皮細胞表面聚糖與腸道病原體結合，從而起到抵抗病原體粘附的功能; （3）具有調節免疫和增強腸道屏障功能的作用，進而提高宿主免疫力[1，7～12]。人乳寡糖的功能與其結構多樣性密切相關，目前已報道的人乳寡糖超過200余種[2，7，13～17]。人乳寡糖由5種單糖組成，分別為葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、巖藻糖（Fuc）及N-乙酰神經氨酸（唾液酸，NeuAc），其結構的組成方式都遵循一個基本規律（圖1）：以乳糖（Galβ1-4Glc）為還原端，通過β1-3或β1-6連接的Galβ1-3GlcNAc（Type Ⅰ）或Galβ1-4GlcNAc（Type Ⅱ）單元進行延伸（最多可重復25次），形成不同的直鏈或分支的人乳寡糖核心結構。同時，核心結構經常被不同數目、不同連接方式的巖藻糖和唾液酸修飾，唾液酸通常以α2-3或α2-6的方式連接在半乳糖上，以α2-6的方式連接在N-乙酰葡萄糖胺上; 而巖藻糖則以α1-3的方式連接在葡萄糖上，以α1-3或α1-4的方式連接在N-乙酰葡萄糖胺上，以α1-2的方式連接在半乳糖上。當巖藻糖分別連接在N-乙酰葡萄糖胺或半乳糖上時，可以形成不同的組織血型抗原決定簇。例如，巖藻糖以α1-4的方式連接到Type Ⅰ結構中的N-乙酰葡萄糖胺上形成Lea抗原，以α1-3的方式連接到Type Ⅱ結構中N-乙酰葡萄糖胺上形成Lex抗原，以α1-2的方式連接在半乳糖上形成H抗原。除上述結構外，在人乳寡糖結構中也發現具有A/B血型抗原決定簇，即在H抗原基礎上，繼續連接N-乙酰半乳糖胺形成A抗原或連接半乳糖形成B抗原[2，13，14]。

人乳寡糖結構組成復雜，連接方式多樣，異構體眾多，為其結構解析帶來了較大的挑戰，并且隨著寡糖聚合度增加，人乳寡糖還會出現各種分支結構，結構復雜程度進一步增加，致使高聚合度的寡糖異構體的分離和鑒定變得更加困難[18， 19]。目前，寡糖結構解析采用的方法主要包括質譜法、甲基化分析法、糖苷酶酶解法和核磁共振波譜法等[1，20，21]。其中，電噴霧-四極桿-飛行時間質譜法（Electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometry，ESI-Q/TOF-MS）具有靈敏度高、精確度高、糖樣品消耗少和無需衍生化等優點，是一種常見的寡糖異構體解析方法。Chai等[22，23]在負離子模式下，通過解析寡糖斷裂產生的C、D和A型等二級碎片對人乳寡糖進行了結構分析。劉世龍等[24]和韓瑤等[25]運用此方法分別鑒定了一些中性人乳寡糖和酸性人乳寡糖的結構， 但目前多數研究僅限于對人乳中高含量且聚合度相對較低的人乳寡糖進行結構分析，對于含量較低的高聚合度人乳寡糖異構體尚未有系統的結構解析方法的報道。

本研究對分離獲得的18種高聚合度人乳寡糖進行了詳盡的結構解析，首次報道了3種微量的高聚合度寡糖結構，并對多組復雜同分異構體進行了區分，為復雜的高聚合度人乳寡糖異構體的解析及新型糖結構的發現提供了依據。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Agilent 1290 infinity超高效液相色譜儀、6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF質譜儀（Agilent 公司）。色譜純乙腈（Sigma Aldrich公司）; 實驗用水為超純水（Milli-Q Reference，Millipore 公司）; 寡糖樣品為實驗室前期分離制備的寡糖單體。

2.2?實驗方法

2.2.1?人乳寡糖單體的分離制備?取適量人乳樣品，采用低溫離心、乙醇沉淀方法獲得去脂去蛋白的寡糖總餾分[26]。一維制備色譜通過Click TE-GSH制備柱（300 mm×100 mm， 10 μm）分離得到中性寡糖、乳糖和酸性寡糖餾分[27]。二維制備色譜通過XAmide制備柱（300 mm×50 mm， 10 μm）將寡糖餾分分離，得到聚合度分別為3～9及以上的單聚合度寡糖餾分。最后，通過石墨化碳色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）依次對聚合度分別為6～9的中性糖進行三維分離，獲得寡糖單體[15]。制備過程中得到的餾分和單體均采用質譜測定分子量，根據圖1所示的人乳寡糖組成規律和寡糖計算器軟件[16]確定寡糖的聚合度和單糖組成。

2.2.2?質譜分析?將純化樣品溶于乙腈-水（1∶1，V/V）中，配制成1 mg/mL的樣品溶液。流動相采用乙腈-水（1∶1，V/V），流速0.2 mL/min，進樣量10 μL; 質譜條件：ESI電噴霧離子源; 負離子掃描模式; 質量掃描范圍m/z 100～2000; 毛細管電壓3.5 kV; Fragmentor電壓75 V; 碰撞能10～45 eV; 數據分析軟件Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.04.00。

3?結果與討論

3.1?樣品的選擇

在前期的工作中，采用多維液相色譜從人乳中分離制備得到47個寡糖單體，其中包含多個高含量且聚合度相對較低的寡糖異構體，如LNT/LNnT、LNFP I/LNFP Ⅱ/LNFP Ⅲ、3'SL/6'SL等。這些寡糖異構體的解析已經有較多報道[22]，可以通過比對文獻進行結構鑒定，但所獲得的高聚合度系列寡糖異構體的結構解析鮮有報道。本研究選取了18個高聚合度中性人乳寡糖異構體進行系統研究，通過一級質譜確定其分子量，進而根據圖1所示的基本規律確定其單糖組成。為方便區分各異構體，采用以分子量和后綴的方式進行命名，包括：分子量為999.36的同分異構體4個，分別命名為999-1、999-2、999-3和999-4，其單糖組成為Glc1Gal2GlcNAc1Fuc2; 分子量為1218.43的同分異構體4個，分別命名為1218-1、1218-2、1218-3和1218-4，其單糖組成為Glc1Gal3GlcNAc2Fuc1; 分子量為1364.49的同分異構體6個，分別命名為1364-1、1364-2、1364-3、1364-4、1364-5和1364-6，其單糖組成為Glc1Gal3GlcNAc2Fuc2; 分子量為1510.55的同分異構體2個，分別命名為1510-1和1510-2，其單糖組成為Glc1Gal3GlcNAc2Fuc3; 分子量為1161.41的同分異構體2個，分別命名為1161-1和1161-2，其單糖組成為Glc1Gal3GlcNAc1Fuc2。

3.2?999-1/2/3/4寡糖異構體的結構解析

此系列的4個同分異構體結構相對簡單，Chai等[22]已對其進行了較全面的結構解析，可以直接通過比對文獻進行歸屬。通過對這組異構體的解析，闡述寡糖異構體的結構解析思路，總結重要的斷裂規律及特征碎片，以便于對更高聚合度寡糖異構體的結構解析。

該組異構體的組成為Glc1Gal2GlcNAc1Fuc2，沒有分支結構，異構體之間的主要結構差異表現為核心結構類型（Type Ⅰ/Ⅱ）的不同及兩個巖藻糖的位置異構，因此，在譜圖分析中應重點關注這兩點。對比各異構體的二級質譜圖（文后支持信息圖S1），可發現999-1和999-2（支持信息圖S1A和S1B）具有相同的碎片m/z 690.3，該碎片是寡糖丟失Glc1Fuc1產生的C3碎片，證明在999-1/2中含有Fucα1-3Glc的結構。與此同時，支持信息圖S1 C和S1D中無該碎片，證明999-3/4中無此結構。999-1和999-2的差異主要在m/z 348.1和m/z 364.1的碎片，分別是Lea（Fucα1-4GlcNAc）和Lex（Fucα1-3GlcNAc）產生的特征D碎片，據此可以確定999-1另外一個Fuc連接在Type Ⅰ結構中GlcNAc的4位，而999-2另外一個Fuc連接在Type Ⅱ結構中GlcNAc的3位。因此，999-1的結構序列為Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）Glc，999-2為Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）Glc。在999-3/4譜圖中均含有m/z 325.1的碎片，該碎片是H血型抗原決定簇（Fucα1-2Gal）的特征C碎片，由此可知，在999-3/4結構中含有Fucα1-2Gal結構，而999-3譜圖中m/z 348.1給出了另外一個巖藻糖的結構信息，由此推斷999-3的完整序列結構為Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。經過對999-1/2/3的結構推斷后，異構體999-4另外的巖藻糖只能以α1-3的方式連接在GlcNAc上，因此，999-4的完整結構為Fucα1-2Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，其特征的D碎片m/z 510.2證明了此結構的正確性。

采用ESI-Q/TOF-MS負離子模式對人乳寡糖進行解析時，特征碎片對于確定各個單糖之間具體的連接方式，尤其是確定Type Ⅰ/Ⅱ結構類型以及巖藻糖連接位置，具有非常重要的作用。此外，其它一些斷裂規律，如3位連接鍵容易斷裂進而產生高豐度的D碎片，而4位連接會產生低豐度的A型碎片等，都有助于對于異構體的解析。表1列出了人乳寡糖異構體常見的特征碎片，以便于下一步復雜寡糖異構體的歸屬及解析。

3.3?1218-1/2/3/4寡糖異構體的結構解析

在人乳寡糖的組成中，如含有兩個及以上Galβ1-3/4GlcNAc（Type Ⅰ/Ⅱ）單元時，則需判斷人乳寡糖的核心結構是直鏈，還是分支結構。1218系列寡糖異構體的單糖組成為Glc1Gal3GlcNAc2Fuc1，含有兩個Galβ1-3/4GlcNAc（Type Ⅰ/Ⅱ）單元，所以應先判斷此系列中的異構體的核心結構類型。通常，直鏈的人乳寡糖結構容易產生一系列的C斷裂的碎片，根據C斷裂的信息可以推測寡糖連接順序，而分支結構則容易產生丟失3位支鏈結構的Dβ碎片，在此采用Chai等[23]對人乳寡糖的命名方法，將6位支鏈發生的斷裂用α后綴表示，將3位支鏈發生的斷裂用β后綴表示。

對比1218系列異構體的二級碎片譜圖發現，異構體1218-1（圖2A）含有一系列的C型碎片（C1，m/z 179.1; C2，m/z 382.1; C3，m/z 544.2; C5，m/z 1055.4），尤其是通過C3（m/z 544.2）碎片可以確定其為直鏈結構; 碎片0，2A2（m/z 281.1及其脫水碎片m/z 263.1）證明非還原端含有Galβ1-4GlcNAc（Type Ⅱ）結構; 通過D4-4α（m/z 729.3）可以確證Fuc連接在中間GlcNAc的3位。因此，1218-1的完整序列結構為Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。由圖2B～2D可知，都缺少一系列C碎片，并且都存在由3位支鏈斷裂生成的D2β-3碎片，據此可確定1218-2、1218-3和1218-4是分支結構。1218-2存在明顯的D2β-3（m/z 672.2）碎片，證明6位支鏈上含有Fuc，由m/z 364.1可確證其6位支鏈為Lex結構，但從譜圖中仍不能判斷3位支鏈Type Ⅰ/Ⅱ的結構。異構體1218-3和1218-4出現了完全相同的譜圖，通過特征碎片D2β-3（m/z 526.2）和0，2A2（m/z 281.1/263.1）可以確定其6位結構都為Galβ1-4GlcNAc，同理，因為3位支鏈的信息缺失而無法判斷最終結構。因此，僅通過[M-H]產生的二級碎片離子可以進行直鏈寡糖（如1218-1）和分支結構中6位支鏈的結構分析，但因缺少3位支鏈的具體信息而不能對分支結構的異構體進行完整結構的鑒定。

二級質譜圖可以同時提供寡糖3位和6位支鏈所有的信息[23]，因此，通過比對 [M-H]和[M-2H]2的二級質譜圖，根據新出現的碎片即可推斷寡糖3位支鏈的信息，據此可進一步分析1218-2/3/4。與圖2B相比，圖3A中新出現的碎片m/z 202.1是-3GlcNAc產生的特征碎片，證明1218-2的3位支鏈為Type Ⅰ（Galβ1-3GlcNAc）結構。與圖2C相比，圖3B中新出現的碎片m/z 202.1和m/z 325.1可證明1218-3的3位支鏈結構為Fucα1-2Galβ-3GlcNAc。而圖3C與圖2D比較，根據新出現的碎片m/z 364.1， 可確定1218-4的3位支鏈含有Lex結構，即Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。1218-2、1218-3和1218-4的完整結構序列見支持信息表S1。

綜上，隨著寡糖聚合度的增加，寡糖異構體容易產生分支結構，需要分別通過寡糖一價離子[M-H]和二價離子[M-2H]2的二級質譜圖才能解析完整結構。值得一提的是，1218-4的結構雖然在靈長類動物乳中有報道[28]，但在人乳中是第一次被確認。Lebrilla等[2]利用Chip-MS等方法也曾檢測到該糖，但由于其使用方法的局限，只給出了可能的兩種結構，沒有給出準確的結構，而本研究通過對人乳樣品系統的分離得到了該糖，并解析出其準確的結構。

3.4?1364-1/2/3/4/5/6的結構解析

1364系列的寡糖異構體與1218系列相比，組成中僅多了一個巖藻糖，結構的復雜性明顯增加，且異構體的數目隨之增加，各異構體[M-H]的譜圖見支持信息圖S2。異構體1364-1和1364-2具有一系列的C碎片（C1，m/z 179.1; C3，m/z 690.3; C5，m/z 1201.4），其中特征碎片C3（m/z 690.3）證明二者均為直鏈結構。高豐度的m/z 875.3顯示兩個異構體的結構中均有一個Fuc連接在中間GlcNAc的3位，而二者的區別在于非還原端分別為Lea和Lex。因此，1364-1的完整序列結構為Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，而1364-2為Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。其余4個1364異構體都含有明顯的D2β-3碎片，應為分支結構。其中，1364-3與另外3個支鏈寡糖不同，D2-2β（m/z 526.2）證明其6位連接的是Gal和GlcNAc，通過0，2A2（m/z 281.1/263.1）可進一步確定6位支鏈結構為Galβ1-4GlcNAc。1364-4、1364-5和1364-6的[M-H]產生的二級譜圖完全一致，根據D2β-3（m/z 672.2）和D1α-2α（m/z 364.1）碎片可以確定其6位支鏈寡糖的結構均為Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。

為確定3位支鏈寡糖的結構，進行了[M-2H]2二級質譜解析。對比支持信息圖S3A和圖S2C可知，新出現的碎片為C1β（m/z 325.1）和D1β-2β（m/z 348.1），所以1364-3的3位應為Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc。對比支持信息圖S3B和S2D中新出現的D1β-2β（m/z 202.1）和C1β（m/z 325.1），可以確定1364-4的3位為Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc; 對比支持信息圖S3C和S2E中新出現的D1β-2β（m/z 348.1）可以證明1364-5的3位為Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc; 而與支持信息圖S2F相比，圖S3D沒有出現新的碎片信息，證明該糖3位與6位支鏈寡糖的結構相同，所以確定1364-6的3位為Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。1364-3、1364-4、1364-5和1364-6的結構序列見支持信息表S1。

3.5?1510-1/2寡糖異構體的結構解析

1510系列寡糖異構體中有含有3個巖藻糖結構，結構組成更加復雜，分離純化的難度也相應提高，因此，本系列異構體僅制備獲得2個單體。異構體1510-1（支持信息圖S4A）含有一系列的C碎片（C1，m/z 325.1; C2，m/z 674.3; C3，m/z 836.3; C5，m/z 1347.5），根據特征碎片C2（m/z 674.3）和C3（m/z 836.3）可以確定其為直鏈結構，通過特征碎片C1（m/z 325.1）、D1-2（m/z 348.1）和D4-4α（m/z 1021.4）可以確定1510-1中3個巖藻糖的位置，其完整結構序列為Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。在異構體1510-2的[M-H]二級質譜圖（支持信息圖S4B-i）中出現了明顯的D2β-3（m/z 672.2），證明1510-2為分支結構，由D1α-2α（m/z 364.1）碎片確定6位支鏈寡糖的結構為Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。對比[M-H]和[M-2H]2二級質譜圖可知，新出現的特征碎片為C1β（m/z 325.1）和D1β-2β（m/z 348.1），可確證3位支鏈寡糖的結構為Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc，1510-2的完整序列結構見支持信息表S1。

3.6?1161-1/2寡糖異構體的結構解析

1161系列寡糖異構體組成與其它人乳寡糖有一定的差異性，不符合圖1所示的基本規律。其分子量與999系列寡糖相差162，推斷此系列寡糖組成中多了一個Gal，組成為Glc1Gal3GlcNAc1Fuc2。因此，在進行結構解析時，除確定直鏈或分支結構、Type Ⅰ/ Ⅱ結構類型及兩個巖藻糖的連接方式外，還需判斷Gal的位置及連接方式。

1161-1（圖4A）含有一系列的C碎片（C2，m/z 487.2; C3，m/z 836.3; C4，m/z 998.4），根據特征碎片C2（m/z 487.2）和C3（m/z 836.3）可以確定1161-1為直鏈寡糖，且m/z 348.1碎片可以確定有一個Fuc連接在GlcNAc的4位。然后推測Gal的連接位置和另一個巖藻糖的位置，m/z 487.2的特征碎片證明寡糖中含有Gal2Fuc1的結構。通常Fuc連接在非還原端Gal-1上時會產生C1（m/z 325.1）碎片，而譜圖中沒有出現C1碎片，證明Fuc并未連接在非還原端Gal-1上。與此同時，D1-2（m/z 307.1/247.1）的存在進一步證明Fuc連接在Gal-2上，且Gal-2與Gal-1是通過3位相連，該結構序列符合B型抗原決定基Galα1-3（Fucα1-2）Gal [14，20]。因此，推測1161-1是B型抗原寡糖，其完整序列結構為Galα1-3（Fucα1-2）Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。

圖4B-i具有與圖4A明顯不同的碎片，根據D1β-3（m/z 672.2）碎片可以確定1161-2為分支結構，特征碎片D1α-2α（m/z 364.1）和D1β-3（m/z 672.2）則證明1161-2的6位支鏈寡糖結構為Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc; 與圖4B-i相比，圖4B-Ⅱ中新出現的碎片為C1β（m/z 325.1），由此確定1161-2的3位支鏈結構為Fucα1-2Gal。因此，1161-2的完整序列結構為Fucα1-2Galβ1-3（Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-6）Galβ1-4Glc。

1161系列寡糖異構體組成上不符合人乳寡糖基本規律，結構差異較大，尚未見其它文獻報道。研究者早已發現人乳寡糖中存在A/B型抗原，但報道的寡糖種類并不多，尤其是B型抗原[13，14]。1161-1結構中含有B型抗原，同時含有Leb結構; 1161-2的核心結構與目前已知的13種常見人乳寡糖核心結構不同，同時含有H抗原和Lex，此組異構體的發現進一步豐富了人乳寡糖的結構類型。

4?結 論

采用ESI-Q/TOF-MS技術對18個高聚合度人乳寡糖異構體進行了結構解析，包括分子量999和1218的同分異構體各4個，分子量1364的同分異構體6個，分子量1510和1161的同分異構體各2個。其中，3個人乳寡糖1161-1、1161-2和1218-4的結構未見報道。在負離子模式下，通過C型碎片確定寡糖的序列信息，根據D型碎片和A型碎片確定寡糖的連接方式，結合[M-H]和[M-2H]2二級質譜確定分支寡糖3位和6位支鏈的信息，利用特征碎片和裂解規律完成了高聚合度人乳寡糖同分異構體的結構解析，為人乳寡糖同分異構體的區分和新型糖結構的發現提供了依據。

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