王舉波,權 瑜,呂 健,董丹鳳

(1西安交通大學第二附屬醫院神經外科,西安 710004;2西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科;*通訊作者,E-mail:54257589@qq.com)

腦膠質瘤具有高發病率、高復發率、高死亡率的三高特點,在全身腫瘤中,其5年死亡率僅次于胰腺癌和肺癌,居第3位。它起源于神經上皮組織,是中樞神經系統中最為常見的顱內原發惡性腫瘤,無論兒童還是成人,總體預后不佳[1]。在中樞神經系統腫瘤中,以其高致死致殘率而危害最大,給家庭及社會帶來沉重負擔。高侵襲、無序增殖及代謝紊亂是膠質瘤細胞的顯著特性[2-4],因而深入研究其侵襲發生發展機制具有重要的臨床與社會意義。

三羧酸循環是細胞氧化還原代謝的重要途徑,而異檸檬酸脫氫酶是三羧酸循環中的重要限速酶。人類基因共編碼三種異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH),其中IDH1主要分布于細胞質內和過氧化物酶體內,而IDH2和IDH3主要分布于線粒體內[5]。IDH1基因突變在膠質瘤中有廣泛的基因突變譜,研究顯示在低級別膠質瘤中突變率達到76%[6],而在原發膠質母細胞瘤中卻不足5%。相關研究發現突變型IDH1基因(mutant isocitrate dehydrogenase 1,mIDH1)亞型膠質瘤預后相對優于野生型IDH1(wild isocitrate dehydrogenase 1,wIDH1)膠質瘤患者[6],而侵襲性是膠質瘤細胞最為顯著的特性,對膠質瘤患者的預后有著重要影響。本研究旨在探討mIDH1過表達對膠質瘤U87細胞系侵襲能力的影響,從而了解膠質瘤不同亞型預后差異的原因,并通過進一步了解膠質瘤的發生發展機制為尋求膠質瘤治療的有效靶點,為個體化治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人膠質瘤細胞株U87細胞系由西安交通大學醫學院中心實驗室提供,基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2);基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)兔抗人單克隆抗體購買于Santa Cruze公司,胎牛血清采用四季青公司產品,脂質體Lip2000系Sigma公司產品,基質膠、Transwell小室購自上海玉博生物科技有限公司,Western-blot試劑盒系上海銳賽公司產品,Pcmv-IDH1模板及p-EGFP-1質粒空載體購自上海奧克生物技術公司。實驗用相關基本試劑及試驗耗材均購自西安交通大學實驗耗材供應中心,無菌超凈臺、培養箱、電泳儀、酶標儀、熒光顯微鏡等試驗儀器均由西安交通大學醫學院中心實驗室提供。

1.2 細胞培養

人腦膠質瘤細胞株U87細胞用含有100 IU/ml青霉素、100 IU/ml鏈霉素、100 ml/L胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃培養箱、50 ml/L CO2條件下培養,定時換液、傳代。

1.3 真核表達載體構建與目的基因細胞穩定轉染

Primer5軟件設計引物如下。p1(模板鏈引物):5′-ATCGAGCTCAGGAACTGGGGTGATAAGA-3′；p2(反義鏈引物):5′-CGCGGATCCTTCACAAAGGTGGCAATAAC-3′；模板Pcmv-IDH1 SEQUENCE 225-1466為人IDH1 cDNA克隆載體;對IDH1 PCR產物及p-EGFP-C1質粒利用限制性內切酶BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切,并對目的片段回收,T4 DNA Lig對反應體系進行連接重組,構建wIDHI1真核表達載體,根據點突變試劑盒說明構建mIDH1真核表達載體,大腸桿菌感受態對真核表達載體擴增,方法如下。

取預先制備好的感受態DH5a,冰上解凍,加入1 μl質粒(連接產物),冰上放置30 min,42 ℃熱激90 s,冰上放置2 min,加入900 μl LB培養基(卡那霉素陰性),37 ℃ 150 r/min振蕩培養45 min,4 000 r/min離心5 min,吸棄800 μl上清液,剩余培養液重新混懸,吸取100 μl均勻涂菌,將培養皿正放置15 min,于37 ℃培養箱中倒置培養過夜(14 h);過夜的培養可見有散在的菌落生長,于消毒超凈臺中分別用消毒牙簽選取6個單克隆菌落,分別加入到錐形瓶中,每個錐形瓶中加入10 ml LB培養基(卡那霉素陽性),瓶口擰緊后回擰一圈,于37 ℃溫箱內以180 r/min震蕩培養過夜(12-14 h)。將菌液用干凈的1.5 ml EP管分兩次收集3.0 ml菌液中的細菌,室溫條件下離心,1 000 r/min,1 min,棄去上清液;按照質粒提取試劑盒操作步驟提取質粒。

細胞接種,融合率達60%-70%時,按脂質體Lip2000試劑說明書轉染細胞,G418篩選,篩選步驟如下:取對數生長期細胞消化,調整細胞濃度為1.5×105/ml,制成均一的細胞懸液,用移液器吸取1 ml加入到24孔培養板中,培養18 h左右,吸棄24孔板中的培養液,向每個培養孔中加入含10%胎牛血清培養液1 ml,按照0,200,400,600,800,1 000 μg/ml的G418濃度加入到每一縱列培養孔中,每個濃度設4個復孔。每2 d換完全培養基一次,觀察至10 d,細胞恰好完全死亡的所在孔的G418濃度即為最佳抗性篩選濃度,以此G418濃度進行篩選,直至單克隆細胞株出現,因目的基因重組后與p-EFPF-C1有共同的啟動子,所以熒光顯微鏡下能看到EGFP表達即可確定目的基因表達。單克隆細胞株篩選成功后進行傳代培養,凍存留種備用。

1.4 實驗設計與分組

根據mIDH1、wIDH1及空載體對照(p-EGFP-C1)目的基因的不同,將轉染相應目的基因的膠質瘤穩轉細胞系分為mIDH1組、wIDH1組及空載體對照組,以劃痕愈傷實驗檢測其細胞遷移增殖能力,細胞免疫熒光法監測其MMP-2及MMP-9的表達差異,Transwell法監測其侵襲能力的差異;對應的裸鼠移植瘤模型定義為mIDH1組、wIDH1組及空載體對照組,采用免疫組化法檢測其體內組織中MMP-2及MMP-9表達差異。

1.5 劃痕愈傷實驗檢測膠質瘤細胞體外遷移能力

穩定轉染細胞正常傳代,待細胞匯合度達到90%左右時,用100 μl的移液槍頭在培養瓶底壁上做劃痕,細胞常規換液培養24 h,24 h后于顯微鏡下觀察膠質瘤細胞對劃痕的愈傷修復情況,顯微鏡高倍鏡下分別計數劃痕范圍內5個視野的細胞數,比較每組細胞之間增殖遷移細胞數的差異,結果以均數±標準差形式表示。

1.6 Transwell法檢測細胞體外侵襲能力

將小室放入到24孔培養板中,將Matrigel基質膠用無血清高糖DMEM培養液按比例稀釋,在每個Transwell小室內加入配好的基質膠50 μl,Transwell小室置入24孔板,在37 ℃細胞培養箱中孵育4 h,用2%的牛血清白蛋白PBS溶液漂洗Transwell小室2次,每次5 min,使基質膠充分水化。細胞計數種植,每種細胞設置4個復孔,實驗結果重復三次,底層加入200 ml/L的血清誘導,培養24 h后取出Transwell小室,倒棄上室液體,用棉簽輕輕擦盡上室內未穿膜細胞及Matrigel膠,結晶紫溶液染色15 min,PBS漂洗2次,于倒置顯微鏡下觀察細胞移行情況,每個小室的上下左右及中央選取5個顯微鏡視野,光鏡下計數5個視野的侵襲細胞數,觀察轉染mIDH1、wIDH1及空載體對照基因膠質瘤細胞的體外侵襲能力差異。

1.7 細胞免疫熒光染色檢測膠質瘤細胞體外MMP-2、MMP-9表達水平

穩定轉染膠質瘤細胞傳代培養,顯微鏡下計數調整細胞濃度。在24孔板內加入10-20 μl培養液,將用酸處理并消毒過的蓋玻片緩慢置入其中,避免氣泡產生。用移液器取適量的細胞懸液接種于24孔板內,37 ℃細胞培養箱內常規培養24 h,讓細胞爬行鋪貼于玻片上;將鋪有細胞爬片的培養孔內的剩余培養液吸凈,預熱PBS輕柔漂洗培養孔2次;將4%多聚甲醛溶液適量加入到有細胞爬片的培養孔內,固定15 min;PBS漂洗2次,0.5%Triton打孔15 min,PBS漂洗2次;棄去PBS緩沖液,1%BSA封閉液封閉30 min;加入1%BSA稀釋的一抗(1 ∶5 000)30 μl于細胞爬片上,將24孔培養板置入濕化盒中,于4 ℃過夜孵育18-24 h;加入1% BSA稀釋的二抗(1 ∶2 500)30 μl于細胞爬片上,37 ℃溫箱內孵育45 min,PBS漂洗2次;加入抗淬滅劑封片;倒置熒光顯微鏡下觀察有無肉眼可見的熒光表達差異。

1.8 構建目的基因穩轉細胞的裸鼠移植瘤模型

純系裸小鼠,由西安交通大學醫學院動物研究中心代購于上海中科院動物研究所,SPF級實驗室內分組專人獨立飼養,受試動物4-5周齡大小,體質量20-21 g,隨機分為3組,每組6只。mIDH1、wIDH1過表達細胞及空載體對照組細胞分別傳代培養,待細胞達到足夠數量時,常規消化、離心、收集細胞,細胞計數、重懸、離心收集細胞,用適量的無血清DMEM高糖培養基制成細胞懸液,每只裸鼠接種細胞數為1×107,裸鼠背部皮膚碘伏局部消毒,用1 ml注射針吸取1×107個細胞,于背部皮膚消毒處將注射針斜45°刺入皮下,接種腫瘤細胞懸液,每日觀察裸鼠一般情況,1-2周后裸鼠移植瘤建模成功,成瘤后頸椎脫位法處死裸鼠,剝離腫瘤組織,記錄分析實驗數據,將腫瘤組織分塊標記備用。

1.9 免疫組化檢測瘤組織細胞MMP-2、MMP-9表達水平

取石蠟固定的組織切片,將石蠟塊固定于切片機,按5 μm厚度切片,40 ℃水浴中載玻片撈片,在二甲苯中脫蠟5 min,再換用新鮮的二甲苯脫蠟,共用二甲苯脫蠟3次。乙醇梯度脫蠟,檸檬酸鈉抗原修復,獗找封閉60 min。參考MMP-2、MMP-9一抗說明書進行一抗孵育(1 ∶2 500),4 ℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育1 h。參考二抗說明書,按照適當比例進行二抗孵育(1 ∶1 000),室溫在側擺搖床上緩慢搖動孵育1 h,顯微鏡下觀察免疫組化結果,分別計數分析高倍鏡下10個細胞進行比較,結果判定標準如下:按陽性率和著色強度進行計分，以細胞內見棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性細胞。按陽性細胞面積計分:不表達為0分,<10%記1分,10%-50%記2分,51%-80%記3分,>80%記4分;按著色強度計分:不表達記0分,弱表達記1分,中度表達記2分,強表達記3分。兩者積分乘積為0表示陰性,>1為陽性,1-3表示弱陽性,4-7表示陽性,8-12為強陽性。陰性對照:利用PBS代替一抗作空白對照。

1.10 統計學處理

所有數據均用SPSS16.0統計軟件進行處理與分析。數據描述采用均數±標準差表示,組間比較采用方差分析(One-Way ANOVA)進行評價,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 真核表達載體構建成功

目的基因及構建的真核表達載體經基因測序證實無誤,并與酶切鑒定圖譜相符(見圖1)。

2.2 U87膠質瘤細胞系穩定表達帶EGFP熒光報告基因的目的基因

實驗確定G418最佳篩選濃度為400 μg/ml,以此濃度對瞬時轉染目的基因的U87膠質瘤細胞系進行穩定轉染篩選,經2周篩選可見單細胞克隆株出現,經傳代培養可穩定表達帶綠色熒光報告基因的目的基因(見圖2)。

A. IDH1 PCR產物 B. wIDH1/mIDH1表達載體雙酶切鑒定圖1 IDH1擴增產物及wIDH1/mIDH1真核表達載體鑒定Figure 1 Identification of IDH1 products and eukaryotic expression vector

圖2 U87穩轉細胞穩定表達EGFP熒光報告基因 (×40)Figure 2 EGFP fluorescent reporter gene expressed in U87 stable cell line (×40)

2.3 mIDH1抑制膠質瘤U87細胞體外劃痕愈傷移行能力

將mIDH1、wIDH1及對照組穩定轉染膠質瘤細胞做劃痕實驗后繼續培養24 h,結果顯示:與對照組比較,mIDH1組的細胞劃痕修復愈傷能力較差,wIDH1組細胞劃痕修復愈傷能力較強(見圖3)。劃痕范圍內每高倍鏡視野下可見遷移增殖細胞(50.8±5.8)個,與wIDH1過表達組每高倍鏡視野下遷移增殖細胞數[(114.4±9.6)個]比較,差異有統計學意義(P<0.01),與空載體對照組遷移增殖細胞數[(96.4±7.2)個]比較,差異有統計學意義(P<0.01),wIDH1過表達組與空載體對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4 mIDH1抑制膠質瘤U87細胞體外侵襲能力

用Transwell血清誘導法檢測膠質瘤細胞侵襲能力的差異可見,mIDH1組細胞侵襲穿膜細胞數為27.3±4.2,低于wIDH1組(65.2±7.1)及空載體對照組(63.4±6.7),差異有統計學意義(P<0.01),wIDH1組與空載體對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 細胞免疫熒光顯示mIDH1抑制U87細胞體外MMP-2、MMP-9表達

對mIDH1、wIDH1及對照組穩轉細胞系,免疫熒光法檢測細胞MMP-2、MMP-9表達水平,UV激發,藍光下觀察顯示細胞發出紅色熒光,mIDH1發出的熒光較另外兩組更為微弱,而wIDH1及空載體對照組無肉眼可見差別(見圖4)。

圖4 U87細胞MMP-2、MMP-9免疫熒光表達 (×40)Figure 4 MMP-2/MMP-9 immunofluorescence expression in glioma cells (×40)

2.6 成功構建裸鼠移植瘤模型

對受試的18只純系裸小鼠皮下分別給予mIDH1、wIDH1及空載體對照穩轉細胞注射植入(每組6只),經飼養2周后全部成瘤,可于注射位置見腫瘤贅生物生長(見圖5)。

wIDH1 mIDH1 空載體對照組 圖5 構建成功的裸鼠移植瘤模型Figure 5 Established nude mouse transplantation model

2.7 mIDH1對膠質瘤細胞體內MMP-2、MMP-9表達的影響

裸鼠成瘤實驗中,處理得到的標本進行石蠟固定切片,免疫組化技術檢測wIDH1、mIDH1及空載體對照基因對膠質瘤MMP-2及MMP-9表達水平的影響(見圖6)。根據免疫組化結果判定標準,裸鼠移植瘤模型中免疫組化檢測到mIDH1組中MMP-2、MMP-9表達水平較低,免疫組化染色積分為2.6±1.2和2.2±0.8,而空載體對照組中,免疫組化染色積分為7.2±2.4和5.4±1.2,二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。而在wIDH1組中MMP-2、MMP-9表達水平均較高,免疫組化染色積分為8.4±2.8和7.0±1.2,與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。提示體內試驗中mIDH1影響膠質瘤細胞的MMP-2、MMP-9表達水平,產生表達下調作用,從而降低膠質瘤的侵襲能力;而wIDH1組對MMP-2、MMP-9表達無明顯上調。

圖6 裸鼠移植瘤中MMP-2、MMP-9免疫組化表達水平 (×100)Figure 6 MMP-2/MMP-9 immunohistochemical expression in nude mice xenograft tumor model (×100)

3 討論

膠質瘤的惡性生物學行為是一個多因素多階段相關的事件,瘤細胞的遷移與侵襲能力是評估腫瘤細胞惡性行為的一個重要指標,也是影響患者預后的一個重要因素[7,8]。腫瘤細胞的遷移、侵襲過程包括局部黏附定植、局部細胞外基質的溶解重塑、細胞游走遷移三個重要過程,瘤細胞受到趨化因素的誘導進行遷移游走,又在鈣黏素等黏附分子的介導下,在組織局部定植黏附下來。之后,腫瘤細胞分泌出水解酶,水解破壞細胞之間的基質,破壞細胞之間的基質連接,突破細胞基底膜,達到侵襲的目的。基質金屬蛋白酶是一個龐大的蛋白水解酶超家族,每種基質金屬蛋白酶能水解至少一種細胞外基質,為腫瘤細胞的侵襲遷移提供支持。尤其關于MMP-2、MMP-9在膠質瘤中的相關研究,更是顯示了其表達水平與患者預后的相關性,成為膠質瘤侵襲能力的預測指標。

本研究中,劃痕愈傷實驗顯示了細胞遷移和增殖能力方面的差異,培養瓶內的細胞基本為單層生長或復層生長,如果細胞厚度增加,將導致片狀脫離瓶壁,因而僅僅靠細胞的增殖堆積能力來完成培養瓶底壁上的劃痕愈傷修復是不現實的,細胞必須要有一定的運動遷移能力,故而遷移能力可能是起主導作用的因素。盡管這是一個反映增殖與運動遷移綜合作用的實驗,但是我們仍然不難看出,mIDH1過表達細胞及空載體對照組的遷移能力要低于wIDH1過表達組,而wIDH1過表達細胞的增殖遷移能力似乎高于空載體對照組細胞。因而,IDH1基因可能起到促細胞增殖遷移的作用。Transwell實驗中觀察到穿過Matrigel基質膠的細胞數存在差異,從統計學分析穿膜細胞數的差異可以得出,mIDH1低于對照組和wIDH1過表達組,而對照組與wIDH1過表達細胞組之間的差異并無統計學意義。因而我們分析,IDH1的基因突變可能導致了腫瘤細胞侵襲能力的改變,準確地說是降低了細胞的侵襲能力,而wIDH1過表達組與空載體對照組之間的結果相似性提示我們,IDH1基因過表達并不直接導致細胞侵襲能力提升。

當然,腫瘤患者的預后是一個多因素相關事件,其中腫瘤侵襲性是一個不可忽視的因素,尤其在膠質瘤患者中。因中樞神經系統缺乏淋巴系統,再加上血腦屏障的存在,膠質瘤的血行轉移與淋巴轉移罕見。對于膠質瘤患者,腫瘤浸潤性生長是其大的特性。以MMP-2、MMP-9為代表的基質金屬蛋白酶家族是一個蛋白水解酶超家族,在腫瘤的侵襲過程中發揮著重要的作用,它可以降解細胞外基質,促成膠質瘤細胞的遷移,并促進新生血管的形成,通過重塑細胞外基質增加細胞的浸潤潛能[9,10]。目前,在許多人類腫瘤中都檢測到了基質金屬蛋白酶的表達,并且發現它與腫瘤的進展及患者的預后有較為密切的關系[11-13]。因而考慮,在膠質瘤患者中,IDH1攜帶者的相對良好預后是否來源于其腫瘤侵襲能力的下降,基于此假設,對mIDH1和wIDHI1穩定表達膠質瘤細胞中的MMP-2、MMP-9水平進行了檢測。

在本實驗研究中,檢測到基因突變組過表達細胞系的MMP-2、MMP-9蛋白表達水平較低,也就意味著突變的膠質瘤細胞與對照組及野生型IDH1過表達組相比,有著相對較低的細胞浸潤能力,這也正好與Transwell實驗中的結果相互印證。當然,不能單從細胞侵襲能力來將突變的IDH1基因看做腫瘤基因,低表達的MMP-2、MMP-9水平對應的低侵襲能力告訴我們顯示,這與mIDH1膠質瘤患者相對良好的預后相一致。鑒于IDH1突變型膠質瘤細胞的浸潤能力較低,不能輕而易舉地降解各種細胞外基質成分,在自然狀態下,其浸潤速度應慢于同級別野生型膠質瘤細胞,故而有相對良好的預后。

總之,腫瘤的發生發展是一個多因素參與的過程,但mIDH1通過降低MMP-2、MMP-9的表達水平從而降低膠質瘤細胞的侵襲遷移能力已被該研究證實,這為我們深入探討膠質瘤的治療方法提供了一個新的思路,為膠質瘤的個體化治療乃至靶向治療提供了新的基礎理論支持。