高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成中CA-074 Me對JAK2/STAT3信號通路的影響

王永瑞,孔 麗,王文娟,李宸宇,周國宏*

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院眼科,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)解剖教研室;3山西省眼科醫(yī)院淚道病科;*通訊作者,E-mail:guohongzhou2005@163.com)

視網(wǎng)膜新生血管性疾病是嚴(yán)重的致盲性眼病,以視網(wǎng)膜表面出現(xiàn)大量新生血管為其特征,發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,可能與多種細(xì)胞因子及信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前公認(rèn)的最重要的血管生成促進(jìn)因子。Cathepsin B是一種半胱氨酸組織蛋白酶,普遍存在于人體各組織[1],在視網(wǎng)膜新生血管形成中與VEGF存在一定的相關(guān)性,抑制Cathepsin B能下調(diào)VEGF的表達(dá)[2]。JAK2/STAT3信號通路在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用,可激活VEGF[3],抑制JAK2/STAT3能抑制VEGF的表達(dá)[4]。因此,我們推測抑制Cathepsin B可能通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路抑制VEGF的表達(dá),從而抑制視網(wǎng)膜新生血管形成。本研究將Cathepsin B的抑制劑CA-074 Me作用于小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型,研究視網(wǎng)膜新生血管形成過程中CA-074 Me對JAK2/STAT3信號通路的影響,進(jìn)一步揭示視網(wǎng)膜新生血管形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

7日齡C57BL/6J小鼠44只,雌雄不限,清潔級,體質(zhì)量4.0-5.0 g。動(dòng)物房照射12 h/黑暗12 h,溫度(22±2)℃,相對濕度50%-60%。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格依照由國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。將小鼠隨機(jī)分為正常對照組(11只22眼)和高氧處理組(33只66眼)。正常對照組小鼠在自然環(huán)境中與母鼠共同喂養(yǎng);高氧處理組小鼠參照改良Smith法建立OIR模型[5],與母鼠共同置于氧體積分?jǐn)?shù)為(75±2)%的密閉氧箱內(nèi)喂養(yǎng)5 d。12日齡小鼠造模成功后出氧箱,隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)組,每組均有11只22眼(n=22)。實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)注射5%水合氯醛(0.1 ml/10 g體質(zhì)量)麻醉[6],麻醉妥后,散雙瞳,微量注射器從角膜緣后1 mm垂直進(jìn)針刺入玻璃體腔,分別給予DMSO和CA-074 Me(溶于DMSO溶劑中,100 mg/L)1 μl。正常對照組和模型組的小鼠不予任何藥物干預(yù)。繼而所有小鼠均在自然環(huán)境中喂養(yǎng)5 d直至17日齡。

1.2 主要試劑及儀器

CA-074 Me(美國Biomol公司);EZNATMTotal RNA Kit I(美國Omega公司);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(上海生工生物科技有限公司);RNA裂解酶(美國Sigma公司);兔抗鼠JAK2抗體、兔抗鼠STAT3抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗,β-actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。氧箱(青島科凱電子研究所有限公司);解剖顯微鏡(蘇州六六有限公司);熒光顯微鏡(德國Leica公司);多功能數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 視網(wǎng)膜鋪片觀察新生血管

從每組的17日齡小鼠中隨機(jī)各取2只,參照文獻(xiàn)[2]描述的方法,水合氯醛全身麻醉后,取異硫氰酸葡聚糖熒光素(FITC-dextran,相對分子質(zhì)量為2×106)50 mg,溶于1 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液,行小鼠左心室灌注。灌注后立即摘除小鼠雙側(cè)眼球,置于4%中性緩沖甲醛固定液中浸泡固定3 h,解剖顯微鏡下去除角膜、晶狀體及玻璃體后,將視網(wǎng)膜組織完整剝離,以視乳頭為中心做4個(gè)放射狀切開,將視網(wǎng)膜平鋪于載玻片上,滴少量生理鹽水,加蓋玻片,立即置于熒光顯微鏡下觀察、拍照并保存圖片。

1.4 real-time PCR法檢測視網(wǎng)膜內(nèi)JAK2和STAT3 mRNA

從每組的17日齡小鼠中隨機(jī)各取4只,經(jīng)頸椎脫臼法處死后,取雙側(cè)眼球,獲取視網(wǎng)膜。按EZNATMTotal RNA Kit I試劑盒說明書提取視網(wǎng)膜總RNA,按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,分別PCR擴(kuò)增JAK2和STAT3基因。應(yīng)用Primer 3軟件設(shè)計(jì)PCR引物,JAK2基因上游引物:5′-TCTGTGGGAGATCTGCAGTG-3′,下游引物:5′-TTTCAGAGCTGTCATCCGTG-3′;STAT3基因上游引物:5′-GACCCGCCAACAAATTAAGA-3′,下游引物:5′-TGGTGTCCAGTTTACCACGA-3′;β-actin上游引物:5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′,下游引物:5′-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-3′。PCR條件:94 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃變性15 s,60 ℃退火和延伸60 s,共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后提取real-time PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線數(shù)據(jù)。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法[7]計(jì)算β-actin、JAK2和STAT3 mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 Western blot法檢測視網(wǎng)膜內(nèi)JAK2和STAT3蛋白

每組剩余的5只17日齡小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死,取雙側(cè)眼球,獲取視網(wǎng)膜,用裂解液裂解。參照文獻(xiàn)[2]描述的方法,每組視網(wǎng)膜組織分別置于1.5 ml Eppendorf管中,95 ℃作用5 min,迅速冰浴,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,收集上清;SDS-PAGE(5%的濃縮膠,8%的分離膠:JAK2,15%的分離膠:STAT3、β-actin)分離蛋白樣本;電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5%牛血清白蛋白溶液4 ℃封閉過夜;分別加入兔抗鼠JAK2單克隆抗體或兔抗鼠STAT3單克隆抗體,4 ℃孵育過夜,洗滌,加入抗兔IgG二抗,孵育,洗滌;ECL底物化學(xué)發(fā)光,顯影,定影,掃描。以β-actin為內(nèi)參。根據(jù)各組組織中β-actin、JAK2和STAT3蛋白印跡測定的光密度值,以JAK2/β-actin和STAT3/β-actin的比值表示各組中JAK2和STAT3蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下各組小鼠視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)比較

如圖1所示,熒光顯微鏡下可清晰地顯示小鼠視網(wǎng)膜主要小血管和毛細(xì)血管的形態(tài),正常對照組視網(wǎng)膜血管形態(tài)清晰,走行清楚,無新生血管簇、血管滲漏,無缺血無灌注區(qū);模型組和實(shí)驗(yàn)對照組視網(wǎng)膜血管走行迂曲,較多新生血管簇和視網(wǎng)膜缺血無灌注區(qū);實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜血管走行相對清晰,未見明顯的缺血無灌注區(qū)。

A.正常對照組 B.模型組 C.實(shí)驗(yàn)對照組 D.實(shí)驗(yàn)組圖1 熒光顯微鏡下各組小鼠視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)比較 (FITC-dextran,×50)Figure 1 Morphological changes of retinal neovascularization in each group under fluorescence microscope (FITC-dextran,×50)

2.2 小鼠視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3 mRNA相對表達(dá)量比較

各組視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3 mRNA相對表達(dá)量總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(JAK2:F=24.86,P<0.001;STAT3:F=24.22,P<0.001)。與正常對照組相比,模型組和實(shí)驗(yàn)對照組中JAK2和STAT3 mRNA的表達(dá)量顯著增高(P<0.05);與模型組和實(shí)驗(yàn)對照組相比,實(shí)驗(yàn)組中JAK2和STAT3 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)對照組與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

表1 四組視網(wǎng)膜JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)量的比較(2-ΔΔCt)

Table 1 Comparison of JAK2 and STAT3 mRNA expression level in retinas among four groups(2-ΔΔCt)

組別nJAK2STAT3正常對照組80.12±0.040.05±0.02模型組83.79±1.66?1.94±0.87?實(shí)驗(yàn)對照組82.61±1.02?1.15±0.58?實(shí)驗(yàn)組80.54±0.30#0.12±0.07# F24.8624.22 P<0.001<0.001

與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組和實(shí)驗(yàn)對照組比較,#P<0.05

2.3 小鼠視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3蛋白相對表達(dá)量比較

四組視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(JAK2:F=53.90,P<0.001;STAT3:F=35.87,P<0.001)。與正常對照組相比,模型組和實(shí)驗(yàn)對照組中JAK2和STAT3蛋白的表達(dá)量顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組和實(shí)驗(yàn)對照組相比,實(shí)驗(yàn)組中JAK2和STAT3蛋白的表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)對照組與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2、表2)。

表2 視網(wǎng)膜JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量比較

Table 2 Comparison of JAK2 and STAT3 protein expression level in retinas among four groups

組別nJAK2STAT3正常對照組100.38±0.150.32±0.11模型組101.01±0.09?1.02±0.04?實(shí)驗(yàn)對照組100.94±0.09?1.05±0.04?實(shí)驗(yàn)組100.41±0.11#0.50±0.28# F53.9035.87 P<0.001<0.001

與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組和實(shí)驗(yàn)對照組比較,#P<0.05

3 討論

視網(wǎng)膜新生血管是一種病理性的血管,是多種缺血、缺氧性視網(wǎng)膜疾病發(fā)展到終末階段的特征性表現(xiàn),如增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和缺血型視網(wǎng)膜靜脈阻塞等[8,9]。視網(wǎng)膜新生血管發(fā)育不成熟,新生血管的基底膜不完整甚至缺失,血管內(nèi)的大分子物質(zhì)就會漏出至組織間隙,表現(xiàn)為玻璃體積血、黃斑水腫、牽拉性視網(wǎng)膜脫離等改變,視力發(fā)生不可逆的損傷,嚴(yán)重威脅著各個(gè)年齡階段人群的視力健康。

視網(wǎng)膜形成新生血管的機(jī)制極其復(fù)雜,涉及多種細(xì)胞因子及復(fù)雜信號通路的作用。視網(wǎng)膜處于缺血、缺氧等條件時(shí),血管系統(tǒng)內(nèi)的各細(xì)胞因子之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),表現(xiàn)為以VEGF為主的血管生成促進(jìn)因子大幅度的增加等[10-12]。JAK2/STAT3通路是細(xì)胞內(nèi)信號通路,介導(dǎo)多種因子的信號傳導(dǎo),被VEGF等細(xì)胞因子激活后,可進(jìn)入到細(xì)胞核中,調(diào)控細(xì)胞增殖分化和新生血管形成等過程[13,14]。STAT3的異常活化,可調(diào)控STAT3/VEGF信號通路,調(diào)控VEGF的表達(dá)[15,16];抑制JAK2/STAT3通路,則可下調(diào)VEGF[17]。Cathepsin B是一種半胱氨酸組織蛋白酶,參與體內(nèi)多種蛋白的水解,維持著細(xì)胞內(nèi)的平衡。缺血、缺氧等病理?xiàng)l件下,視網(wǎng)膜上分布的Cathepsin B和視網(wǎng)膜新生血管形成密切相關(guān),Cathepsin B和VEGF之間存在雙向調(diào)節(jié)機(jī)制,抑制Cathepsin B可以抑制VEGF的表達(dá)[2]。因此,我們推測抑制Cathepsin B可能通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路抑制VEGF的表達(dá),從而抑制視網(wǎng)膜新生血管形成。

CA-074 Me是Cathepsin B的特異性抑制劑,能抑制視網(wǎng)膜新生血管中Cathepsin B的表達(dá)[18,19]。在本研究中,我們首先建立了小鼠OIR模型,于第17天時(shí),小鼠視網(wǎng)膜表面均出現(xiàn)了大量新生血管,由此證實(shí)了小鼠從封閉的高氧環(huán)境中進(jìn)入到正常環(huán)境后,相對缺氧會誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成。然后我們將CA-074 Me作用于小鼠玻璃體腔,檢測視網(wǎng)膜組織中JAK2和STAT3的表達(dá)情況,研究抑制Cathepsin B對JAK2/STAT3信號通路的影響。我們得到的結(jié)果是:視網(wǎng)膜新生血管形成以后,JAK2和STAT3在視網(wǎng)膜組織中均過度表達(dá);而給予CA-074 Me之后,JAK2和STAT3在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)均受到了抑制。

綜合考慮以上分析,這些結(jié)果提示小鼠從封閉的高氧環(huán)境中進(jìn)入到正常環(huán)境后,視網(wǎng)膜組織中的JAK2和STAT3蛋白會大量釋放并激活JAK2/STAT3信號通路,CA-074 Me可下調(diào)JAK2/STAT3信號通路。這一機(jī)制可能是CA-074 Me抑制Cathepsin B以后,通過Cathepsin B對JAK2/STAT3信號通路的作用實(shí)現(xiàn)的;也可能是CA-074 Me對JAK2/STAT3信號通路的直接作用,需要我們在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。此外,本次實(shí)驗(yàn)我們只選取了44只小鼠,每組僅有11只,樣本量相對較小,所得結(jié)果可能有一定的局限性。相信隨著視網(wǎng)膜新生血管領(lǐng)域研究的深入,有望給視網(wǎng)膜新生血管性疾病的診療提供新的思路和方法。