Neuropilin-1對人舌鱗狀細胞癌TCa8113增殖、遷移能力、細胞凋亡及對化療藥物敏感性的影響

沈耀川,鄭 歆,余巧龍,陳 昕

(中國人民解放軍第一七四醫院口腔科,廈門 361000;*通訊作者,E-mail:dentistchenxin@163.com)

舌鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,也是最常見的口腔癌,約占口腔癌的1/3-1/2[1,2]。近年來舌癌的發病率越來越高,人們對其關注度也隨之增加。舌癌對患者生存率及面容、口腔頜面部功能等影響均較大。目前以手術、化療和放療等為主的傳統治療方法未能取得令人滿意的療效[3-5]。舌癌組織中的血管密度可能影響其生長速度及預后。NRP-1最早是作為神經細胞導向調節因子受體被發現,是一類在脊椎動物中高度保守的分子量為130-140 kDa的糖蛋白[6-8]。近年來大量研究結果顯示,人類的許多腫瘤組織上都有NRP-1的表達,包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌,而在相應的正常組織中幾乎不表達[9-11]。NRP-1作為血管生長因子的共受體,在腫瘤血管新生方面發揮著重要的調節作用。NRP-1在對各種腫瘤細胞的發生發展有重要作用。目前,已有相關文獻報道,舌癌組織中有NRP-1的高表達[12,13],但尚沒有NRP-1對舌鱗狀細胞癌細胞的生物學特性影響的相關基礎研究。本研究旨在初步探討NRP-1在舌鱗狀細胞癌TCa8113細胞的表達及其對TCa8113細胞增殖遷移等生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養液(Gibco);LB培養基(Solarbio);阿霉素(北京中碩科技有限公司);胎牛血清FBS(Gibco);Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific);全自動細胞計數儀(Countstar-全自動細胞計數儀);Transwell細胞培養小室(Corning);高速離心機(Thermo Fisher Scientific);生物顯微鏡(EVOS);NRP-1抗體(2 mg/ml,GeneTex)。

1.2 細胞系與細胞培養

TCa8113細胞野生型細胞(WT-TCa8113)和NRP-1敲低TCa8113細胞(NRP-1KD-TCa8113)購自上海豐暉生物科技有限公司。用含10% FBS和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養液,于37 ℃,5% CO2的培養箱中培養。

1.3 NRP-1單克隆抗體與NRP-1結合能力的鑒定

首先,利用Western blot檢測WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細胞中NRP-1的表達情況。接著使用共聚焦顯微鏡檢測NRP-1抗體與T-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細胞的結合能力。取對數生長期的WT-TCa8113細胞和NRP-1KD-TCa8113細胞,蛋白酶消化后,PBS稀釋成單細胞懸液并加入到含有細胞爬片的6孔板中,制備細胞爬片。待細胞爬片制備完成后,加入熒光素BRITC標記的NRP-1抗體與細胞共同孵育30 min。孵育后,除去培養液,PBS輕輕洗滌3次以除去游離和非特異性結合的抗體。共聚焦熒光顯微鏡下觀察NRP-1單克隆抗體在WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細胞中的結合情況。

1.4 實驗設計及分組

實驗設計共設置2個時間點,每個時間點分三組。PBS組(陰性對照組)采用WT-TCa8113細胞系,加100 μl PBS處理;NRP-1 antibody組采用WT-TCa8113細胞系,加100 μl NRP-1單克隆抗體處理;NRP-1 knockdown組采用NRP-1KD-TCa8113細胞系,加100 μl PBS處理。即本研究通過構建NRP-1敲低TCa8113細胞系和使用NRP-1單克隆抗體兩種方法抑制TCa8113細胞的NRP-1功能,再通過比較兩種方法抑制NRP-1功能后,對WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞12 h和24 h兩個時間點的增殖、遷移、凋亡及對化療藥物敏感性的影響。

1.5 細胞計數儀檢測抑制NRP-1功能對細胞增殖的影響

取對數增長期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞分別稀釋成2×105/ml。按1.4的分組將兩株組細胞分成6組并接種到12孔板,每組設3個復孔。分別在培養后12 h和24 h兩個時間點使用細胞計數儀測細胞數量,每次測量前均使用胰蛋白酶進行消化并用槍頭吹打混勻。

1.6 Transwell檢測抑制NRP-1功能對細胞遷移能力的影響

按1.4的分組將WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株組細胞細胞稀釋成2×105/ml,并分成6組,分別取100 μl加入transwell上腔,下腔放入600 μl含有0.5% BSA的DMEM培養液。于37 ℃,5% CO2條件下培養,分別在培養后12 h和24 h兩個時間點收集下腔的細胞做細胞計數。

1.7 流式細胞儀檢測抑制NRP-1功能對細胞凋亡的影響

取對數生長期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞稀釋成10×104/ml,轉移至6孔板中培養。按1.4的分組將上述兩株組細胞分成6組并做相應處理,于37 ℃、5% CO2條件培養。分別在培養后12 h和24 h兩個時間點收集細胞并用500 μl binding buffer重懸細胞后,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI染色液,混勻后室溫孵育15 min。孵育完畢收集細胞用預冷500 μl PBS重懸后流式細胞儀檢測,計算總細胞量和凋亡細胞量。

1.8 細胞計數儀檢測抑制NRP-1功能對細胞化療藥物敏感性的影響

取對數生長期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞按1.4的分組將兩株組細胞分成6組并做相應處理。用含有不同濃度的表阿霉素(EPI)的培養基稀釋成2×105/ml,每組細胞的EPI終濃度分別為0.001,0.01,0.1,0.2,0.5,1 μg/ml。于37 ℃、5% CO2條件下培養。分別在培養后12 h和24 h兩個時間點使用細胞計數儀計算凋亡細胞和總細胞數。分別計算各組細胞在不同濃度EPI處理下的細胞凋亡率。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 NRP-1敲低細胞株及NRP-1抗體結合能力的鑒定

Western blot結果顯示,野生型細胞WT-TCa8113組在130 kDa附近出現一明顯特異性條帶,與NRP-1理論分子量復合。而NRP-1敲低組NRP-1KD-TCa8113組的NRP-1蛋白表達量較野生型細胞明顯降低。結果表明,成功構建NRP-1敲低的TCa8113細胞株,且敲低效率較明顯(見圖1)。

共聚焦顯微鏡觀察結果顯示,在WT-TCa8113組中,可見明顯紅色熒光在細胞表面集聚,而NRP-1KD-TCa8113組則沒有(見圖2)。結果表明,NRP-1抗體可在活體細胞中與TCa8113細胞膜上的NRP-1結合。

圖1 Western blot檢測WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞株NRP-1蛋白表達量Figure 1 Western blot analysis of NRP-1 expression in WT-TCa8113 and NRP-1KD-TCa8113 cell lines

圖2 共聚焦顯微鏡分析NRP-1抗體與TCa8113細胞膜表面的NRP-1的結合能力Figure 2 Confocal microscopy analysis of the binding ability of NRP-1 antibody to TCa8113 cells

2.2 細胞計數儀檢測抑制NRP-1功能對細胞增殖的影響

以PBS組作為陰性對照,分別比較NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組培養12 h和24 h后的細胞數,評估兩者抑制NRP-1功能后對TCa8113細胞增殖的影響,結果見表1。在0 h時,三組細胞數無統計學差異(P=0.716)，均約為2×105/ml。而培養12 h后,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞數開始較PBS組少,差異有統計學意義(P<0.05)。培養24 h后,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞數與PBS組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組抑制NRP-1功能后,能夠抑制TCa8113細胞增殖,因此可推測,NRP-1具有促進TCa8113細胞增殖的作用。

此外,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組對比,在12 h和24 h兩個時間點,NRP-1 knockdown組的細胞數均小于NRP-1 antibody組,差異有統計學意義(P<0.05)。提示通過shRNA方法構建NRP-1低表達細胞株對NRP-1功能抑制可能更徹底,故對細胞抑制作用更明顯。

表1 抑制NRP-1功能對細胞增殖的影響(×105/ml)

Table 1 Effect of NRP-1 function inhibition on cell proliferation(×105/ml)

分組0 h12 h24 hPBS組2.03±0.183.79±0.355.93±0.44NRP-1 antibody組2.14±0.222.96±0.48?3.71±0.57??NRP-1 knockdown組2.18±0.272.41±0.22?#2.66±0.29??#

與PBS組比較,*P<0.05,**P<0.01;與NRP-1 antibody組比較,#P<0.05

2.3 Transwell檢測抑制NRP-1功能對細胞遷移能力的影響

用Transwell檢測NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞的遷移能力,結果見圖3。NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞遷移能力在12 h和24 h兩個時間點下室細胞量與相應時間段的PBS陰性對照組有顯著差異。12 h時,PBS組,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組下室細胞量分別為428±56,235±43和197±27個。方差分析三組間均數具有統計學意義(P<0.001)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞數比PBS組少,差異具有統計學意義(P<0.01)。

與PBS組比較，**P<0.01圖3 NRP-1抗體和NRP-1敲低對細胞遷移的影響 (n=3)Figure 3 Effect of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on cell migration (n=3)

在24 h時,PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組下室細胞量分別為587±61,398±42和244±37個。方差分析三組間差異具有統計學意義(P<0.001)。其中PBS組細胞數比NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組多,差異具有統計學意義(P<0.01)。結果表明,用NRP-1 antibody和NRP-1 shRNA抑制NRP-1功能后,能夠抑制TCa8113細胞遷移能力。

此外,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組對比,在12 h和24 h兩個時間點的細胞數均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 流式細胞儀檢測抑制NRP-1功能對細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞凋亡情況見圖4。12 h時PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞凋亡率分別為(8.2±1.5)%,(14.9±2.4)%和(24.2±5.8)%,方差分析三組間差異具有統計學意義(P<0.01)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組比PBS組細胞凋亡率低,差異具有統計學意義(P<0.01)。

與PBS組比較，**P<0.01圖4 NRP-1抗體和NRP-1敲低對細胞凋亡的影響 (n=3)Figure 4 Effect of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on apoptosis (n=3)

24 h時PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞凋亡率分別為(10.0±3.7)%,(20.9±3.8)%和(35.4±6.3)%,方差分析三組間差異具有統計學意義(P<0.01)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組比PBS組細胞凋亡率低,差異具有統計學意義(P<0.01)。

此外,NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組12 h時凋亡率差異沒有統計學意義(P=0.082);24 h時兩組凋亡率差異沒有統計學意義(P=0.086)。

2.5 抑制NRP-1功能對細胞耐藥的影響

細胞對化療藥物的敏感性一定程度可以反映細胞的耐藥程度,本實驗通過各組細胞的半數凋亡率的化療藥物濃度來評估NRP-1對細胞耐藥的影響,利用IC50Calculator計算軟件計算各組的IC50,結果見圖5。藥物培養12 h,PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的半數凋亡率的化療藥物濃度分別為(0.48±0.14)μg/ml,(0.19±0.06)μg/ml和(0.11±0.03)μg/ml,NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組與PBS組對比,P值分別為0.016和0.006,差異有統計學意義。NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組對比,兩者半數凋亡濃度無統計學差異(P=0.107)。

藥物培養24 h,PBS組、NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組的半數凋亡率的化療藥物濃度分別為(0.23±0.08)μg/ml,(0.12±0.04)μg/ml和(0.06±0.02)μg/ml,NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組與PBS組對比,P值分別為0.035和0.007。結果表明兩種方法抑制NRP-1功能均能增加細胞對化療藥物的敏感性,使細胞凋亡率增加。NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組對比,兩者半數凋亡濃度無統計學差異(P=0.081)。

圖5 不同處理組處理12 h和24 h后的細胞凋亡率 (n=3)Figure 5 Apoptosis rate after treatment for 12 h and 24 h in different treatment groups (n=3)

3 討論

口腔頜面部惡性腫瘤的發病率居全身惡性腫瘤的第六位,而其中至少有80%是鱗狀細胞癌[14]。口腔舌鱗狀細胞癌惡性程度較高,且易發生淋巴結轉移,預后較差,術后常繼發畸形,對患者生活質量造成極大影響[15,16]。而傳統放化療對舌癌效果不佳,故研究新的治療方式尤為重要。惡性腫瘤的快速生長,需要大量血管為其提供豐富的營養,通過抑制腫瘤內血管生成,從而抑制腫瘤生長,是治療舌癌的重要思路之一[17]。而NRP-1具有獨特的分子結構,其作為Sema3A和VEGF165等細胞因子的多功能受體,并受多種miRNA分子的負向調控,在神經發育、血管生成、腫瘤增殖和轉移、調節免疫等方面發揮著重要作用,特別是其在腫瘤血管新生及腫瘤轉移方面中的作用[18-20]。NRP-1有可能成為未來口腔癌靶向治療的新靶點、新方向。

目前已有相關研究發現,NRP-1在人舌癌組織及細胞系TCa8113中呈高表達,提示可能和舌癌的發生發展有關[12,21]。但是目前仍沒有NRP-1對人舌癌組織及細胞系TCa8113細胞生物學功能的相關基礎研究,NRP-1對舌癌TCa8113細胞生物學特性的影響尚不清楚。本研究以舌癌TCa8113細胞為研究對象,采用敲低NRP-1或NRP-1抗體兩種方法抑制TCa8113細胞NRP-1的功能,與野生型細胞比較,從而探討NRP-1對TCa8113細胞的生物學特征的影響。本實驗中,使用兩種方法抑制NRP-1功能后,TCa8113細胞的增殖能力均顯著降低,而凋亡率則顯著增加,說明NRP-1對TCa8113的發生發展有促進作用。在抑制NRP-1功能后,流式細胞術結果顯示,細胞發生凋亡,且多集中在早期凋亡。該結果與NRP-1在其他腫瘤中的作用相同。唐子春等[22]利用慢病毒介導的RNA干擾技術,特異性抑制NRP-1基因在人舌鱗狀細胞株SCC25中的表達,結果提示NRP-1基因沉默可顯著降低腫瘤細胞的體外遷徙能力。本研究在TCa8113細胞中也得到相同結果。

舌癌的原發或繼發耐藥是導致療效差及復發率與死亡率高的重要原因[23]。近年來,探究舌癌的耐藥機制、如何克服或逆轉耐藥成為口腔舌癌治療的研究熱點。目前有研究報道,NRP-1可能與各類腫瘤的耐藥相關[24-26]。在本研究中,兩種方法抑制NRP-1功能后,細胞對化療藥物的敏感性明顯增加,NRP-1或可成為逆轉舌癌耐藥的一個重要靶點。或可通過NRP-1單克隆抗體抑制NRP-1功能,從而提高舌癌對化療藥物的敏感性。

本研究首次從細胞水平上探討NRP-1對口腔舌癌TCa8113細胞生物學特性的影響研究,但相關的機制仍未探究,后期仍需要更深入探究NRP-1影響TCa8113細胞生物學特性的機制。