芍藥湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織機械屏障及細胞因子的影響

陳大光，曹 暉，李 令，吳東升，劉震宇，陳鴻飛，田 娜

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，常以腹痛、腹瀉和黏液膿血便反復發作為臨床表現[1]。本病屬于中醫學“痢疾”“休息痢”“泄瀉”“腸澼”范疇，基本病機為脾失健運、濕熱內生、內蘊腸腑、氣血瘀滯。因此，在治療上應以清熱燥濕、調和氣血為主。芍藥湯為古今臨床治療本病的經驗方[2]，有清熱燥濕解毒、調氣和血、促進腸道潰瘍愈合的作用，臨床療效顯著，但是其作用機制尚未明確。本研究旨在基于結腸組織機械屏障和炎癥細胞因子角度，探討芍藥湯治療UC的作用機制。

1 材料

1.1 動物 41只SD大鼠，雌性20只，雄性21只，體質量(150±20)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002]。分籠飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物中心實驗室，飼養溫度為24～26℃，濕度為50%～70%。

1.2 藥物 ①芍藥湯按鄧中甲主編的《方劑學》[2]中確定的藥物組成和劑量：芍藥30 g，當歸、黃連、黃芩各15 g，大黃9 g，檳榔、木香、炙甘草各6 g，肉桂5 g。所有中藥飲片均購自于湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房，經水煎煮2次，混合過濾后，濃縮制備成含藥濃度為1 g/mL的藥液，經滅菌后置于冰箱中4 ℃保存備用。②對照藥物：美沙拉嗪緩釋顆粒劑(批號 H20143164，上海愛的發制藥有限公司)，用9.0 g/L氯化鈉注射液配成21 mg/mL的溶液備用。③用于復制模型的藥物：2，4，6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)，美國Sigma;50%乙醇。

1.3 主要儀器 Leica UC7超薄切片機：德國Leica；Ultra 45°鉆石切片刀：瑞士Daitome；HT7700透射電子顯微鏡：日本Hitachi；其他所需耗材均為國產。

1.4 主要試劑 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)試劑盒(批號 201803)、白細胞介素-4(interleukin-4, IL-4)試劑盒(批號 201803)、內毒素(endotoxin, ET)試劑盒(批號 201803)：武漢基因美生物技術有限公司；電鏡固定液(貨號 G1102)：武漢賽維爾生物科技有限公司；812包埋劑(貨號 90529-77-4)：美國SPI；其他試劑均為國產。

2 方法

2.1 UC模型復制與動物分組 按照文獻[3]的方法，采用TNBS/乙醇法復制UC模型。大鼠適應性飼養3 d后，隨機抽取31只大鼠(雌性15只，雄性16只)，禁食、不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉成功后，采取頭低腳高位，將直徑約2 mm聚乙烯管，自肛門緩慢插入直腸約8 cm，灌入TNBS原液100 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，取頭低尾高位，呈20°～30°角，持續30 s，放置籠中，清醒后自由飲食，及時觀察大鼠情況。

將31只UC模型復制成功的大鼠隨機分為3組：模型組(n=10)、美沙拉嗪組(n=10)、芍藥湯組(n=11)，剩余10只為空白對照組。4組均以普通飼料喂養，飲用蒸餾水。模型復制后第7天，空白對照組、模型組各隨機抽取2只大鼠剪取結腸組織病理切片后進行模型評價。第8天開始，對各組大鼠進行灌胃給藥，每日1次，連續1周。美沙拉嗪組每日給予美沙拉嗪混懸液0.42 g/kg灌胃。芍藥湯組每日給予芍藥湯濃縮液11.24 g/kg，每次灌胃容積均為3 mL。空白對照組、模型組大鼠均灌胃生理鹽水3 mL。灌胃給藥7 d后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)將動物麻醉，無菌操作，經腹正中線剖腹，從腹主動脈取血，立即全血離心(3 000 r/min)2 min后分裝血清，-80 ℃冰箱保存備用。于肛門上端8 cm處，剪取病變結腸組織約2 cm，縱向剖開，生理鹽水清洗，備用。

2.2 觀察指標

2.2.1 一般情況觀察 實驗開始后每天觀察大鼠體質量、血便情況、泄瀉程度、UC活動指標等，并按文獻[4]方法進行疾病活動指數(disease activity index, DAI)評分。

2.2.2 DAI評分 包括體質量下降情況、大便性狀和血便。①體質量下降0，計0分；下降1%～5%，計1分；下降5%～10%，計2分；下降10%～15%，計3分；下降15%以上，計4分。②大便性狀：正常，計0分；大便松散，計2分；稀便，計4分。血便：無血便，計0分。③大便隱血：陽性，計2分；肉眼血便，計4分。

2.2.3 結腸組織形態學觀察 環形切取結腸組織1 cm，采用4%多聚甲醛溶液進行固定，石蠟包埋制片，切片脫蠟處理后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色。用顯微鏡觀察切片標本有無潰瘍面、充血、腸絨毛排列情況以及炎癥細胞浸潤等變化。按照病理組織學評分標準[5]對結腸組織形態進行評分：結腸組織無明顯損傷，計0分；損傷表面上皮，計1分；黏膜層潰瘍，固有層炎癥細胞浸潤，黏膜下層水腫，計2分；透壁性炎癥和潰瘍，上皮變形壞死脫落，計3分；透壁性炎癥和潰瘍，略見正常黏膜，計4分；透壁性炎癥和潰瘍，無正常黏膜，計5分。

2.2.4 血清TNF-α、IL-4和ET表達水平檢測 采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-4和ET表達水平。

2.2.5 結腸組織緊密連接 透射電鏡下觀察結腸組織緊密連接形態，包括緊密連接連續性、擴張程度及染色情況。

3 結果

3.1 各組UC大鼠一般情況比較 空白對照組大鼠自由飲食，排便正常，無黏液膿血便，體質量持續上升。模型復制第2天開始，模型組、美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠均出現黏液血便，精神不振，食量下降，毛發散亂，體質量逐漸下降。模型復制3 d后，大鼠體質量下降至最低點，可見稀便，肉眼可見少量血絲、黏液。模型復制7 d，從空白對照組、模型組各隨機抽取2只大鼠，取結腸組織，作病理切片后進行模型評價。模型復制9 d，灌胃失誤致模型組1只大鼠死亡。給藥后美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠體質量逐漸回升，大便黏液肉眼血便減少，逐漸成形，進食增加，精神和毛發情況逐漸好轉。與模型組比較，美沙拉嗪組、芍藥湯組DAI評分顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠臨床癥狀較模型組減輕；美沙拉嗪組與芍藥湯組DAI比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示美沙拉嗪與芍藥湯在緩解臨床癥狀方面作用相當。見圖1。

注：A.空白對照組(n=8)；B.模型組(n=7)；C.美沙拉嗪組(n=10)；D.芍藥湯組(n=11)；與模型組比較，*P<0.05

圖1各組UC大鼠DAI評分比較

3.2 各組大鼠結腸組織形態學變化比較

3.2.1 肉眼下各組大鼠結腸組織形態學變化比較 空白對照組大鼠結腸組織顏色淡紅，黏膜連續完整，無明顯充血水腫及潰瘍；模型組大鼠結腸組織距肛門7 cm處顏色發黑，伴有明顯的潰瘍面；美沙拉嗪組及芍藥湯組結腸組織7 cm以下可見黏膜充血，無明顯潰瘍面。見圖2。

圖2肉眼下各組大鼠結腸黏膜形態比較

3.2.2 光鏡下各組大鼠結腸組織形態學變化比較 空白對照組大鼠結腸上皮組織均完整，組織結構正常，無炎癥細胞浸潤；模型組黏膜層欠完整，可見一潰瘍面深達肌層，腺體排列不規則，大量炎癥細胞浸潤及明顯毛細血管擴張充血；美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結腸組織上皮尚完整，黏膜層稍有缺損，無深達肌層的潰瘍面，有較多炎癥細胞浸潤，腺體排列尚規則，有毛細血管充血。見圖3。與模型組比較，美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結腸組織形態學評分明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結腸病理變化較模型組改善，而美沙拉嗪組與芍藥湯組大鼠結腸形態學評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.美沙拉嗪組；D.芍藥湯組

圖3光鏡下各組大鼠結腸組織形態學變化比較(HE染色，10×40倍)

3.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-4、ET水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，芍藥湯組和美沙拉嗪組大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與美沙拉嗪組比較，芍藥湯組大鼠血清IL-4、ET、TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)。見表1。

注：A.空白對照組(n=8)；B.模型組(n=7)；C.美沙拉嗪組(n=10)；D.芍藥湯組(n=11)；與模型組比較，*P<0.05

圖4 各組大鼠結腸組織形態學評分比較表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-4、ET水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05

3.4 透射電鏡下各組大鼠結腸黏膜緊密連接變化比較 電鏡下空白對照組大鼠結腸組織緊密連接形態完整、連續，無明顯擴張及染色增強現象。模型組大鼠結腸組織緊密連接形態尚完整連續，但有明顯擴張增寬現象，周圍可見大量染色帶包裹。美沙拉嗪組及芍藥湯組大鼠結腸組織緊密連接形態尚完整連續，擴張增寬現象較模型組輕，周圍有少量染色帶。結果表明模型組較空白對照組緊密連接明顯破壞，與UC模型大鼠的臨床表現相符。與模型組比較，美沙拉嗪組、芍藥湯組大鼠結腸組織緊密連接形態破壞情況明顯減輕。見圖5。

4 討論

炎癥反應與黏膜屏障損傷是UC病程中的重要病理變化[6-8]。IL-4是機體中關鍵免疫調節細胞因子之一，其失調可能導致一系列炎癥疾病狀態，包括UC[9]。IL-4是關鍵的Th2細胞因子，并且用于指導免疫應答，在活動期UC中，IL-4能在大量浸潤單核細胞的損傷部位聚集。TNF-α是一種加速炎癥發展并促成炎癥腸病發病的細胞因子[10]，IL-4、TNF-α可能導致患者腸上皮單層細胞受損，上皮細胞缺失，杯狀細胞耗竭，炎癥細胞浸潤，水腫形成，出血和血管擴張[11]。腸黏膜表面上皮細胞形成的選擇性滲透屏障具有營養物質交換和宿主防御功能。這些功能依賴于完整的腸上皮細胞層，這些細胞層由細胞側膜上的細胞-細胞附著物通過緊密連接和附近的粘附連接構成[12]。緊密連接具有選擇性地允許某些離子物質的細胞旁轉運的能力，可特異性調節細胞旁通透性、細胞旁屏障功能，從而限制細胞旁擴散過程及調節細胞旁通道功能[13]。因此，當UC發生時，機體炎癥反應釋放大量炎癥因子，損傷腸上皮細胞緊密連接，破壞腸黏膜機械屏障，ET經破損的腸黏膜進入機體，二次損傷腸黏膜，從而加重臨床癥狀。目前國際上UC管理指南中已公認美沙拉嗪為治療UC的臨床一線用藥[14]。研究發現，美沙拉嗪能夠恢復腸道炎癥期間在TNF-α誘導下出現的E-鈣黏蛋白膜表達的喪失。且美沙拉嗪可以阻止TNF-α對p38MAPK途徑的下調作用，有效激活p38MAPK途徑，通過調節應激反應途徑恢復黏膜腸上皮細胞屏障功能穩態。緊密連接在維持腸黏膜上皮屏障功能穩態中起關鍵作用，而將緊密連接蛋白募集到頂側膜是關閉細胞間隙的關鍵步驟。然而，緊密連接的合成在很大程度上依賴于黏附連接(如E-鈣黏蛋白)形成[15]。美沙拉嗪能通過干擾素-γ恢復E-鈣黏蛋白和β連環蛋白的膜定位促進緊密連接的合成與募集，從而降低屏障通透性[16]。

注：放大3 000倍時，標尺示2 μm；放大8 000倍時，標尺示1 μm，箭頭示結腸黏膜緊密連接

中醫認為，UC病機屬脾失健運，濕熱蘊結腸腑、氣滯血瘀。治宜清熱燥濕、調和氣血為主。芍藥湯中黃芩、黃連性味苦寒，入大腸經，可清熱燥濕、解毒瀉火，以祛除病因，二藥共為君藥；白芍養血和營、緩急止痛，當歸養血活血，木香、檳榔行氣導滯，四藥相配，調氣和血，共為臣藥；大黃苦寒沉降，瀉熱通便，以少量肉桂防苦寒傷中，二藥共為佐藥；甘草調和諸藥，與芍藥相配可緩急止痛，為佐使。諸藥合用，清熱燥濕解毒、調氣和血，下痢可愈。

本研究表明，美沙拉嗪、芍藥湯均能明顯降低UC大鼠結腸組織的DAI評分和血清IL-4、TNF-α、ET含量，減輕UC模型大鼠結腸組織緊密連接結構損傷，且兩者的作用相當。

綜上所述，芍藥湯可能是通過減少血清TNF-α、IL-4、ET含量，修復腸上皮組織緊密連接，減輕炎癥反應，保護腸黏膜機械屏障而發揮治療UC的作用。