麻痹性貝類毒素體外生物毒性檢測方法的建立

于志強，孫 運，陳小青，劉漢偉，馬中春*

(寧波中盛產品檢測有限公司/寧波海關技術中心，浙江 寧波 315000)

貝類毒素是由海洋中的有毒藻類通過食物鏈傳遞給藻食性的貝類，并在其體內蓄積、放大、轉化形成的有毒高分子化合物[1]。進食含有貝類毒素的貝類海洋食品可能造成食物中毒。在所有的貝類產品食物中毒事件中，麻痹性貝類毒素(paralyticshellfish poisoning，PSP)中毒占87%，被公認為是對健康危害最嚴重的之一[2]。我國海洋赤潮毒素中最常見的主要也是麻痹性貝類毒素[3]。因此，對海洋性貝類食品的檢測中麻痹性貝類毒素基本上為必檢項目。目前對于麻痹性貝類毒素的檢測方法主要為小鼠生物法、高效液相色譜法和酶聯免疫測定法[4]。其中小鼠生物法為大多數檢測機構的常用方法。而小鼠生物法不滿足“3R”原則(replacement，reductionandrefinement)的要求，因此尋找一種更加簡便、靈敏、高效、準確的麻痹性貝類毒素檢測方法已經成為我國各個檢測機構的研究重點。

石房蛤毒素(saxitoxin，STX)是麻痹性貝類毒素主要成員之一[5]，具有麻痹性貝類毒素的典型結構與特征，是《GB5009.213-2016食品安全國家標準：貝類中麻痹性貝類毒素的測定》中明確規定的陽性標準品，現階段對麻痹性貝類毒素的檢測方法均是應用石房蛤毒素作為陽性標準品建立的，因此，本研究也采用STX為陽性標準品建立新的體外細胞檢測方法。

神經干細胞(neuralstemcell，NSC)是一類具有自我更新和多向分化潛能的特殊細胞，利用它不僅可以探討神經系統發育的分子機制，也可作為一種替代手段用于中樞神經損傷、退行性疾病和神經性腫瘤等的治療和研究[6]。本研究應用小鼠神經干細胞建立麻痹性貝類毒素體外生物毒性檢測方法，利用其自我更新和分化潛能的特性，其更加接近生物體內神經細胞對麻痹性貝類毒素的反應，檢測結果更準確、靈敏、高效，并且符合“3R”原則，為貝類毒素的檢測提供了研究的新思路、新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 毒素和細胞 石房蛤毒素(CRM-STX-f)，購于加拿大自然研究委員會；小鼠神經干細胞，購于上海素爾生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養基、胎牛血清均購于Gibco公司；B27、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉均購于ThermoFisherScientific公司；堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，b-FGF)和表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)均購于PeproTech公司；胰蛋白酶購于HyClone公司；Cell CountingKit-8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒購于上海同仁化學研究所；烏本苷、藜蘆堿均購自Sigma公司；96孔板購自Costar公司。

CO2培養箱購于德國Binder公司；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；超凈工作臺購于Biox公司；超速離心機購于德國Hermle公司；多功能酶標儀購于美國MolecularDevices(MD)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NSC細胞培養 將凍存的NSC于37℃的水浴中迅速融化，在超凈臺中轉移至裝有已預熱完全培養基的細胞培養瓶中，放入CO2培養箱中培養。培養12 h后，將NSC轉移至離心管中，800r/min離心3 min，棄上清，更換新的完全培養基繼續于CO2培養箱中培養2d。于培養的第4天進行傳代：將NSC球轉移至離心管中，800r/min離心3min，棄上清；用1 mL0.05%的胰酶37℃消化5min(中間輕輕搖動幾次，以保證消化效果更充分)；加入1mL培養基(或PBS)終止消化，輕輕吹打，將細胞球打散，1000r/min離心3min，棄上清重懸后進行傳代。

1.2.2 細胞毒性檢測 NSC接種于96孔培養板中，培養至對數生長期進行標準品的毒性檢測。每孔分別加入170μL培養液和10μL標準品(劑量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ng)，各劑量設5個重復孔，每孔再加10mmol/L的烏本苷10μL及1mmol/L的藜蘆堿10μL。同時設置5個烏本苷及藜蘆堿對照孔，以培養液替代STX陽性劑。另設5孔為只加30 μL的培養基的空白對照孔。將培養板放入細胞培養箱中培養24h，倒置顯微鏡觀察細胞形態。每孔加20 μLCCK-8溶液(注意不要產生氣泡)，輕搖混勻，將培養板在培養箱內孵育2h。用酶標儀在450nm處測定各孔D(450)值。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行數據處理，計算出各組數據的平均數和方差，在Excel中輸入數據，以D(450)值為縱坐標，STX含量為橫坐標建立直角坐標系，繪制標準曲線，通過散點相關性分析得到標準曲線方程，并得到直線相關系數R2以判斷線性關系。

2 結果

2.1 顯微鏡觀察NSC生長情況

顯微鏡下觀察正常NSC生長情況，結果見圖1。NSC培養第1天，為單細胞懸液；于培養第2～3天，NSC聚集成為小神經球；培養第4天，由于NSC克隆增殖，小神經球逐漸增大為大神經球。

2.2 加入STX后各組NSC生長情況

空白對照組NSC生長活躍，形態為正常圓球狀；烏本苷及藜蘆堿對照組可見較多細胞出現腫脹破裂，STX組可見腫脹或破裂死亡的細胞，但細胞形態多為正常(見圖 2)。

2.3 STX各劑量組D(450)值測定

通過酶標儀測定的空白對照組、烏本苷及藜蘆堿對照組以及各STX劑量組平均D(450)值及標準差見表1。

圖1 顯微鏡下觀察神經干細胞生長情況

圖2 顯微鏡下觀察加入STX后各組神經干細胞生長情況

表1 各組D(450)值測量結果

2.4 標準曲線的建立

STX的含量在0.2～1.0ng范圍內與D(450)值呈劑量反應關系，而在1.0～1.4ng范圍內不具有劑量反應關系，其在0.2～1.0ng范圍內得可得到直線回歸方程：y=1.252+0.495x(r=0.9980，P＜0.01)。根據此結果制作出標準曲線，見圖3。

3 討論

圖3 STX細胞毒性試驗標準曲線

現階段，對于麻痹性貝類毒素的檢測方法主要為小鼠生物法、高效液相色譜法和ELISA檢測法，這3種方法都是國家標準GB5009.213-2016中明確提到的檢測方法，并且已被廣大檢測機構所采用，同時小鼠生物法更是由于其檢測結果更接近人體對毒素的反應以及不需要特殊儀器設備等優點，而成為了檢測麻痹性貝類毒素的首選方法[7]。但是該方法也暴露出了很多問題，如小鼠之間存在個體差異，對毒素的敏感性不盡相同，因此，造成了檢測靈敏度不高，結果偏差較大[8]。高效液相色譜法由于麻痹性毒素的標準品較少、儀器設備昂貴、需要專業的技術人員等問題限制了其廣泛的應用于各個檢測機構[9-10]。于兵[11]、羅輝武等[12]一致認為ELISA是快速篩選麻痹性貝類毒素的首選技術，但ELISA檢測法需要應用麻痹性貝類毒素的相關抗體，由于難以獲得大量抗體，造成麻痹性貝類毒素的ELISA檢測試劑盒價格居高不下，使其檢測成本過高，推廣難度較大。綜上，目前急需一種新型檢測方法滿足檢測需要。體外細胞檢測方法由此應運而生，其具有上述3種方法中不可替代的優點：減少動物的使用，檢測成本低，操作簡便。因此，此方法可成為一種新型麻痹性貝類毒素的檢測手段。

本研究應用STX等麻痹性貝類毒素能夠抑制烏本苷和藜蘆堿引起的Na+內流造成的細胞腫脹破裂，減少細胞死亡的原理，建立檢測麻痹性貝類毒素方法。應用96孔細胞培養板，對細胞的需求量不大，應用小鼠神經干細胞，由于其具有自我更新和多向分化的特性，其生理特點更接近于原代細胞，其檢測結果較致瘤化的細胞系更能體現動物體內細胞對毒素的真實反映。同時本方法操作簡便，靈敏度高，制作標準曲線的陽性劑只需納克級，對待檢樣品的需求量較小。并且在一定范圍內測量的吸光度值與STX的含量具有正相關關系，以此初步建立了麻痹性貝類毒的細胞檢測方法。

本研究建立的檢測方法對細胞狀態要求較高，細胞生長活躍可以提高檢測的靈敏度，其后續研究將進一步優化條件并應用建立的細胞檢測方法對待檢樣品進行檢測。