肝泡狀棘球蚴組織中HIF-1α、VEGFA的表達及對血管生成的作用

郭黎姣，姜慧嬌，韓歡歡，楊雄峰，周 青，王小義，李林林2，廖振宇2，陳雪玲2，吳向未

包蟲病(hydatiddisease，HD)是由棘球絳蟲的幼蟲階段引起的一種嚴重威脅生命的人獸共患病[1]，包括泡狀棘球蚴病(Echinoccusmultilocularis)和細粒棘球蚴病(Echinococcusgranulosus)。泡狀棘球蚴病好發(fā)于肝臟，肝泡狀棘球蚴病又稱為肝泡型包蟲病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)，其具有腫瘤樣浸潤性生長和轉(zhuǎn)移的生物特性，損傷肝組織，嚴重者最終引起肝衰竭[2]。張示杰[3]研究發(fā)現(xiàn)，包蟲病與血管生成息息相關(guān)，肉眼觀察泡狀棘球蚴組織內(nèi)外部均有血管生成，可能是泡狀棘球蚴病浸潤、轉(zhuǎn)移等生物行為的重要環(huán)節(jié)之一。李佳琦[4]通過雙源能量成像碘定量技術(shù)對感染泡狀棘球蚴的肝臟進行掃描，其結(jié)果顯示HAE組織內(nèi)缺乏血供或無血供，邊緣區(qū)血供明顯高于HAE組織及正常肝組織。血管內(nèi)皮生子因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor, VEGF)家族包括5個因子，特異性作用于損傷的血管內(nèi)皮細胞，促進骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞遷移和歸巢，已被證明病理狀態(tài)下為惡性腫瘤的血管生成中起至關(guān)重要的作用[6]，其中VEGFA是血管生成的主要調(diào)控因子[5]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是細胞對缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[7]，是介導(dǎo)腫瘤細胞VEGF表達的主要驅(qū)動因子，有助于在腫瘤細胞中建立自分泌信號通路，增加腫瘤侵襲性。

本研究在沙鼠肝泡狀棘球蚴病模型基礎(chǔ)上，通過檢測病灶組織中HIF-1α、VEGFA表達水平變化及病灶部位的MVD-CD34的表達，探討HIF-1α與VEGFA在病變中對病灶局部血管新生的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 實驗動物選擇健康未育的成年雌性沙鼠126只，8～9周，體重(42±5)g，均購于新疆維吾爾族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心。泡狀棘球蚴頭節(jié)接種鼠為人工腹腔感染泡球蚴24周灰倉鼠1只。

1.2實驗試劑與儀器 VEGFA、CD34單克隆抗體購于美國Abcam公司(ab52917、ab81289)；Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；基因引物使用Primer5.0軟件合成，由上海生工生物工程公司合成，β-actin(基因號：NM_007393.5)：上游引物ACTGCTCTGGCTAGCAC，下游引物ACATCTGCTGGAAGGTGGAC；HIF-1α：上游引物CTGCCACTGCCACCACAACTG，下游引物TGCCACTGTATGCTGATGCCTTAG；VEGFA：上游引物GTACCTCCACCATGCCAAGT，下游引物CTACCAGGGTCTCGATTGGA；熒光染料(SYBR Green Ⅰ)購于德國QIAGEN公司。

1.3沙鼠肝泡狀棘球蚴動物模型建立及分組 將126只雌性沙鼠隨機分成空白組(6只)、假手術(shù)組(60只)、模型組(60只)。將沙鼠麻醉后，碘伏消毒腹部，作劍突下正中切口0.5 cm，逐層開腹暴露肝臟，于肝左葉注射原頭節(jié)懸混液0.1 mL(原頭節(jié)提取方法參考文獻[8]，活原頭節(jié)約500個)，假手術(shù)組則注射同體積PBS。沙鼠關(guān)腹后置于保溫箱恢復(fù)體溫，常規(guī)飼養(yǎng)，模型組、假手術(shù)組分別于術(shù)后第3 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d、98 d、112 d隨機取6只沙鼠，安樂死處死沙鼠。各組標(biāo)本均取新鮮病灶非切緣區(qū)組織，每塊標(biāo)本均包括包蟲組織、病灶邊緣區(qū)及正常肝組織待檢。

1.4實時定量PCR(qRT-PCR)檢測組織中HIF-1α、VEGFA mRNA表達水平 各組采用Trizol提取組織總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用SYBR Green，Bio-Rad CFX Manager 3.1系統(tǒng)進行實時PCR分析。PCR循環(huán)由95 ℃ 3 min初始變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s的40個循環(huán)組成。以β-actin作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化參照。采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達水平[9-10]。

1.5病理標(biāo)本制備及免疫組織化學(xué)檢測方法 標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm層厚連續(xù)切片及HE染色。免疫組化SP法檢測組織中VEGFA、MVD-CD34，步驟根據(jù)試劑盒操作說明，DAB顯色，蘇木素核染，樹膠封片。

1.6原位雜交檢測HIF-1α mRNA表達 標(biāo)本用含有1%DEPC的4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水。原位雜交探針為地高辛標(biāo)記的寡核苷酸，雜交信號檢測為DAB顯色，具體步驟參考試劑盒說明書進行。陽性表達為細胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色染色，判定結(jié)果同免疫組化檢測判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.7免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 參考文獻[11]，采用作色強度和陽性百分比評分乘積作為最終評分。著色強度：不顯色或顯色不清為0分，淺棕色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細胞百分比：高倍鏡下隨機取3個陽性視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算平均陽性細胞百分比，≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。MVD-CD34判斷標(biāo)準(zhǔn)：參考文獻[12]，被抗體染色的單個內(nèi)皮細胞或細胞團，無論是否呈管腔，均記為1個微血管，管徑>8個紅細胞直徑及匯管區(qū)血管排除在外。

2 結(jié) 果

2.1組織病理學(xué)特點及MVD-CD34結(jié)果 模型組沙鼠在感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后早期(感染后14 d內(nèi))，鏡下可見穿刺部位結(jié)節(jié)狀肉芽腫形成，結(jié)節(jié)內(nèi)有多個小囊泡，囊泡周圍為壞死組織，炎性細胞浸潤，結(jié)節(jié)內(nèi)MVD-CD34染色陽性，周圍正常肝組織紊亂，肝竇擴張，大量紅細胞浸潤；病灶中期(感染后14～56 d)HAE病灶可見囊壁生發(fā)層和角質(zhì)層形成，角質(zhì)層外肝細胞間MVD-CD34呈高表達，偶可見炎性細胞、內(nèi)皮樣細胞浸潤的增殖區(qū)；病灶晚期(感染后56 d到終末期)HAE組織呈大小不等囊泡，囊泡周圍有明顯的纖維化帶，MVD-CD34低表達，正常肝組織血管擴張明顯(見圖1、2)。假手術(shù)組肝細胞可見不同程度的氣球樣變；空白組呈正常的肝組織結(jié)構(gòu)。

注：分別為造模后3 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d、98 d、112 d圖1 沙鼠感染原頭節(jié)后不同時期的沙鼠肝臟組織HE染色(40×)Fig.1 HE staining of gerbil liver tissue at different stages after gerbil infection in the primordial section (40×)

注：空白組；假手術(shù)組；造模后3 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d、98 d、112 d圖2 不同時間沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)MVD-CD34染色(200×)Fig.2 MVD-CD34 staining of the marginal zone of the genital alveolar echinococcosis at different times (200×)

2.2HIF-1α、VEGFA mRNA表達水平 模型組沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)HIF-1αmRNA在術(shù)后隨著感染時間延長，其表達量呈先升高后下降再升高趨勢；術(shù)后14 d其表達量(4.653±1.397)，高于空白組(1.000±0.001)，低于假手術(shù)組(10.567±1.715)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=82.732，P<0.001)；術(shù)后42 d時，HIF-1α mRNA表達量最高(26.712±3.747)，顯著高于空白組(1.000±0.002)、假手術(shù)組(1.230±0.233)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.536,P<0.003)；模型組HIF-1α mRNA術(shù)后42 d后開始下降，術(shù)后84 d 再次升高，術(shù)后112 d HIF-1α相對表達量為(11.343±2.439)，均高于空白組(1.000±0.002)、假手術(shù)組(0.472±0.051)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.189,P<0.001)。模型組沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)VEGFA mRNA表達趨勢與HIF-1α mRNA表達趨勢相似，在術(shù)后14 d其表達量(0.305±0.034)低于空白組(1.00±0.001)、假手術(shù)組(1.648±0.141)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.174,P<0.01)；隨著感染時間延長，術(shù)后42 d時表達量最高(2.912±0.123)，與空白組(1.000±0.002)、假手術(shù)組(0.478±0.099)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.158,P<0.01)；術(shù)后112 d時其表達量(1.823±0.113)，均高于空白組(1.000±0.001)、假手術(shù)組(0.352±0.172)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.158,P<0.01)，見圖3。

2.3HIF-1α、VEGFA、MVD-CD34蛋白染色結(jié)果 HIF-1α原位雜交結(jié)果顯示，空白組、假手術(shù)組HIF-1α mRNA表達均為陰性，模型組術(shù)后第14 d HIF-1α mRNA主要表達在病灶炎性細胞、內(nèi)皮細胞核中，邊緣區(qū)肝細胞及間質(zhì)細胞呈陰性表達；術(shù)后第42、112 d HIF-1α mRNA主要在病灶邊緣區(qū)肝細胞、內(nèi)皮細胞細胞核內(nèi)表達。隨著沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)時間不同，HIF-1α表達程度不同，呈先升高后下降趨勢，術(shù)后第42 d表達最高，與空白組、假手術(shù)組及其他時間點比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4，表1。

VEGFA免疫組化陽性表達部位以泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)內(nèi)皮細胞、肝細胞胞漿及胞外。隨著沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)時間點不同，VEGFA在邊緣區(qū)表達程度不同，呈先升高后下降趨勢，術(shù)后第42 d邊緣區(qū)VEGFA表達最高，與空白組、假手術(shù)組及及其他時間點比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5，表1。

注：**P<0.01; ***P=0.001；A不同時間點各組HIF-1αmRNA表達水平；B不同時間點各組VEGFA mRNA表達水平。 圖3 不同時間點各組HIF-1α、VEGFA mRNA表達水平Fig.3 HIF-1α and VEGFA mRNA expression levels in each group at different time points

HIF-1αVEGFA14d42d112d14d42d112d空白組0002.000±0.6322.000±0.6322.000±0.632假手術(shù)組1.000±0.6320.833±0.7531.000±0.2521.000±0.6321.833±0.7532.167±0.753模型組6.667±0.0118.833±2.7141.833±0.7533.000±0.8947.667±1.3661.732±0.651F/χ28.6729.00015.69011.25070.0590.326P0.0030.0030.0000.0010.0000.727

圖4 沙鼠感染泡狀棘球蚴后不同時期HIF-1α mRNA表達(200×)Fig.4 HIF-1α mRNA expression in gerbils infected with Echinococcus granulosus (200×)

CD34免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，空白組、假手術(shù)組除匯管區(qū)、中央靜脈外無CD34陽性表達；模型組沙鼠在感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后第14 d CD34主要表達在纖維囊壁形成部位；第42 d外囊壁形成晚期囊壁形成后，外囊壁外側(cè)邊緣區(qū)肝細胞間CD34呈高表達，與空白組、假手術(shù)組及及其他時間點比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6，表2。

圖5 沙鼠感染泡狀棘球蚴后不同時期VEGFA表達(200×)Fig.5 VEGFA expression in different periods after gerbils infected with Echinococcus granulosus (200×)

14d42d112d空白組0.333±0.5160.333±0.5160.333±0.516假手術(shù)組0.500±0.8370.167±0.4080.167±0.408模型組23.167±3.31242.667±4.8855.667±1.003F/χ212.51713.15713.220P0.0020.0010.001

3 討 論

本次研究在沙鼠泡狀棘球蚴動物模型的基礎(chǔ)上，根據(jù)沙鼠肝臟感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)時間不同，其病理變化呈動態(tài)改變，通過病灶形態(tài)及特點大致分為3期：感染原頭節(jié)早期14 d內(nèi)，病灶呈結(jié)節(jié)狀“肉芽腫”，血管新生伴大量巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，隨著感染時間延長，病灶中心出現(xiàn)壞死區(qū)；感染中期(14 d～56 d)泡狀棘球蚴組織典型生發(fā)層和角質(zhì)層開始形成，且角質(zhì)層外可見炎性細胞、內(nèi)皮細胞浸潤的增殖區(qū)；感染晚期(56 d后)泡狀棘球蚴組織可見大小不等的囊泡，囊泡周圍有明顯的纖維化帶，與周圍正常肝細胞界限明顯，周圍正常肝組織內(nèi)血管擴張明顯，病灶三期病理特征變化，與相關(guān)研究[13]相符，病程進展與接種原頭節(jié)數(shù)量、宿主種類及宿主與原頭節(jié)之間的耐受性密切相關(guān)[14]。

早期對肝泡狀棘球蚴病研究過程中，血管生成常被忽視，隨著對泡型包蟲病的研究深入，血管生成在其病程進展中的作用越來越受到關(guān)注。Liu等[15]通過采用CT灌注檢測HAE病變的微循環(huán)，其結(jié)果顯示HAE病變邊緣區(qū)有不同程度的血液灌注，且血流量、血容量及微血管密度具有很好的相關(guān)性。泡狀棘球蚴原頭節(jié)感染肝臟后，細胞生成因子及趨化因子是炎性細胞及髓樣細胞向病變局部歸巢的主要作用因子，同時也是病灶向周圍正常肝組織細胞浸潤的重要因子[16]。泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)的血管生成不僅與炎癥細胞進出病灶部位參與免疫逃逸有關(guān)，而且與病灶向周圍正常組織浸潤和遠端轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。本次研究通過對沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后不同時間點的CD34表達觀察，其結(jié)果顯示病灶邊緣區(qū)CD34呈陽性表達，且隨著感染原頭節(jié)時間延長，病灶邊緣區(qū)CD34表達不同。病灶早期以結(jié)節(jié)狀肉芽腫形成為主，血管生成伴大量炎性細胞浸潤，周圍正常肝組織無血管生成；中期隨著病灶中心壞死區(qū)擴大，外囊壁的逐漸形成，微血管向周圍正常肝組織中生長，包蟲外囊壁周圍正常肝組織內(nèi)可見MVD-CD34陽性表達，偶可見炎性細胞、內(nèi)皮細胞浸潤的增殖區(qū)；晚期至終末期，MVD-CD34陽性表達較早、中期顯著減少。沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)血管生成在病程的早、中期最為顯著，其中病灶中期微血管向周圍正常肝組織內(nèi)浸潤生長，可能是泡狀棘球蚴組織呈腫瘤樣浸潤生長的重要因素。

缺氧是肝臟局部炎癥和血管生成的主要誘導(dǎo)因子，可以作為刺激血管生成的單獨因素[17-18]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是真核細胞缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和O2穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子。缺氧條件下，由于缺乏羥化酶所需的激活物，導(dǎo)致HIF-1調(diào)胞質(zhì)內(nèi)蓄積[19]，發(fā)生核轉(zhuǎn)位并與HIF-1β二聚化。HIF二聚體與靶基因啟動子中的缺氧原件(HRE)結(jié)合，上調(diào)許多血管生成基因的表達誘導(dǎo)血管生成中的細胞增殖和分裂[20]，包括VEGF、PLGF、PDGFB、AngPT1、AngPT2等，其中VEGF/VEGFR被認為是腫瘤血管生成的主要調(diào)控系統(tǒng)。VEGFA是VEGF家族中主要成分，參與腫瘤生長、侵襲、血管生成等過程，是促血管生成的最重要因子[21]。沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后不同時間點泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)HIF-1α與VEGFA的mRNA表達特征(圖3)，提示在肝臟感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后，局部病灶中HIF-1α可能對VEGFA的表達具有調(diào)控作用。結(jié)果表明(圖4，5，6)，HIF-1α mRNA在沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)有不同程度的表達，其中術(shù)后42 d病灶外囊壁外側(cè)肝細胞、內(nèi)皮細胞細胞核內(nèi)表達最顯著，局部VEGFA、MVD-CD34同樣高表達；隨感染時間延長，感染56 d后HIF-1α mRNA表達降低，VEGFA、MVD-CD34表達量隨之降低，這一時相在病變邊緣區(qū)可能存在HIF-1α上調(diào)VEGFA的表達促進血管生成的級聯(lián)反應(yīng)，以滿足泡狀棘球蚴原頭節(jié)生長所需的氧及其他營養(yǎng)物質(zhì)，具體級聯(lián)通路有待更深入研究。在病灶早期，結(jié)節(jié)狀肉芽組織局部炎癥反應(yīng)明顯，炎性病灶與周圍肝組織無明顯界限，HIF-1α在內(nèi)皮樣浸潤細胞核中高表達，肉芽組織中大量微血管生成，而VEGFA在炎癥局部表達不明顯，在周圍肝組織內(nèi)呈高表達，考慮在病灶早期，肉芽腫內(nèi)血管生成主要與缺氧引起的炎癥反應(yīng)、纖維化有關(guān)。

肝泡狀棘球蚴組織向周圍正常肝組織呈浸潤生長，加大了手術(shù)治療的難度。血管生長是泡狀棘球蚴組織浸潤性生長的關(guān)鍵因素之一。了解泡狀棘球蚴組織在發(fā)生發(fā)展中血管生成情況及其血管生成機制可能是治療該疾病的關(guān)鍵所在，有望為該疾病靶向治療提供新思路。

利益沖突：無

引用本文格式：郭黎姣，姜慧嬌，韓歡歡，等.肝泡狀棘球蚴組織中HIF-1α、VEGFA的表達及對血管生成的作用[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35(7)：639-646. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.083