蛹蟲草玉米肽功能性飲料的研制及其抗氧化活性研究

李冠龍，鄭喜群，劉曉蘭，鄧永平

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾，161006)3(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶，163319)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北冬蟲夏草，屬子囊菌亞門、核菌綱、球殼目、麥角菌科、蟲草屬，與冬蟲夏草同屬異種[1]。蛹蟲草的營養價值與冬蟲夏草相似，含有蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸等多種生物活性物質，在抗菌、抗癌、增強人體免疫力等方面有重要作用[2]。目前，以蛹蟲草為原料的產品主要包括化妝品、藥品和保健食品等[3]，而蛹蟲草飲料在市場上卻幾乎沒有。

玉米肽是以玉米蛋白粉為原料，通過蛋白酶水解得到的具有生物活性的小分子肽。玉米肽在很大的pH范圍內能徹底溶解于水，對熱穩定，安全可靠，無毒副作用，是一種天然的食品蛋白[4]。玉米肽富含多種人體所必需的氨基酸[5]，并且易于人體吸收。特殊的氨基酸組成和連接方式賦予玉米肽多種生物活性，如抗疲勞、促進乙醇代謝、抗氧化、抗癌等[6-8]。

市面上大多數的飲料都是碳酸和果汁類，具有保健功能的飲料較少，正是由于市場上功能飲料的匱乏，并且隨著人們越來越注重生活水平和自身身體素質的提高，所以功能飲料擁有廣闊的發展前景。賈俊杰等以蛹蟲草速溶粉為原料，研究了其對小鼠腸道菌群的影響，發現蛹蟲草固體飲料對于抗生素干擾引起的腸道菌群失調具有較好的修復作用，可調節并保持腸道微生態菌群的平衡[9]。樸美子等研究了蛹蟲草黃豆粉發酵飲料對小鼠免疫和降血脂功能的影響，發現蛹蟲草黃豆粉發酵飲料有較好的提高免疫力和降血脂的功效[10]。蛹蟲草作為藥食同源的大型真菌，既可滿足人們對食品風味的需求，長期食用又可預防高血壓、腦血栓等高危疾病。因此，本文以蛹蟲草和玉米肽為主要原料，通過正交試驗確定最佳配比和體外抗氧化活性，研制具有抗氧化、降血壓、提高免疫力、降低血栓傾向等多種功效的功能性飲料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹蟲草、玫瑰花干、蜂蜜，均為市售；玉米肽，購自齊齊哈爾易翔公司；乙基麥芽酚、檸檬酸、檸檬酸鈉和VC，均為國產食品級產品；無水乙醇、DPPH、FeSO4、H2O2等均為分析純試劑，購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平(BSA124S)和酸度計(PB-10)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；CR21G高速冷凍離心機和Primaide高效液相色譜儀，日立公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；粉碎機，山東金普分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 蛹蟲草的浸提條件的確定

設定溫度分別為30、40、50、60和70 ℃，浸提時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 h，通過苯酚硫酸法對浸提液蟲草多糖含量進行測定，以蟲草多糖含量為指標確定蛹蟲草的最佳浸提條件。

1.3.3 蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例確定

在玉米肽添加量為10 g/L、檸檬酸添加量為0.15 g/L、 乙基麥芽酚添加量為1 g/L、蜂蜜添加量為80 g/L的條件下，設定蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水(取1 g玫瑰花加入500 mL水在80 ℃下浸提30 min) 的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1，利用感官評定方法，確定蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例。

1.3.4 飲料配方單因素條件優化

設定蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例為2∶1，以飲料的感官評分為指標，分別考察玉米肽(5、10、15、20、25 g/L)、乙基麥芽酚(0.5、1、1.5、2 g/L)、蜂蜜(60、70、80、90 g/L)和檸檬酸(0.1、0.15、0.2、0.25 g/L)添加量對產品感官品質的影響。

1.3.5 最佳配方的確定

選取蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例、玉米肽的添加量、蜂蜜添加量和檸檬酸添加量為因素，進行L9(34)正交試驗，確定各參數的最佳配比。因素與水平見表1。

表1 飲料配方正交試驗因素與水平表Table 1 Orthogonal test factors and levels of beverage formula

1.3.6 感官評價法

挑選 20 人對飲料進行感官評定，以產品的色澤、口感、氣味及組織狀態4個因素作為感官評價指標進行打分，總分為100分，其中口感、氣味、色澤和組織狀態分別占25%、20%、15%和10%。評分標準如表2所示。

表2 感官評價表Table 2 Sensory evaluation table

1.3.7 理化指標檢測

血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力[11]；苯酚硫酸法測定飲料中總糖的含量[12]；高效液相色譜法測定飲料中蟲草素含量[13]。

1.3.8 抗氧化活性的測定

將蛹蟲草飲料成品稀釋10倍，進行抗氧化活性測定,以Vc作為對照。

(1)DPPH·清除率的測定

DPPH·清除率的測定參考文獻[14] 的方法，清除率的計算公式如式(1)：

(1)

式中：Ai，樣品吸光度值；Aj，樣品與無水乙醇的吸光度值；A0，DPPH無水乙醇的吸光值。

(2)·OH清除率的測定

·OH清除率的測定參考文獻[15]的方法，清除率的計算公式如式(2)：

(2)

式中:Ai，樣品吸光度值；Aj，無水楊酸的吸光度值；A0，空白對照的吸光度值。

(3)還原力的測定

還原力的測定參考文獻[16] 的方法。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草浸提條件的確定

2.1.1 溫度的優化

在料液比為1∶50(g∶mL)，浸提時間為2 h時，用苯酚硫酸法分別測定在30、40、50、60和70 ℃下的浸提液蟲草多糖含量，結果如圖1所示。

圖1 浸提溫度對蛹蟲草多糖含量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on Cordyceps militaris polysaccharide content

由圖1可知，隨著溫度的升高，分子熱運動加快，多糖含量也隨之增加，50 ℃之前，溫度較低，多糖含量增加的比較緩慢。溫度升高，對細胞的破壞作用加大，有利于多糖的浸出。當浸提溫度為60 ℃時，多糖提取量為20 mg/mL，繼續溫度升高，多糖含量有所下降，故浸提溫度60 ℃為宜。

2.1.2 浸提時間的優化

在料液比為1∶50(g∶mL)，溫度為60 ℃，用苯酚硫酸法測定30、60、90、120、150、180、210和240 min浸提液蛹蟲草多糖含量，結果如圖2所示。

圖2 提取時間對蟲草多糖含量的影響Fig.2 Effect of extraction time on Cordyeps militaris polysaccharide content

由圖2可知，浸提時間為30～120 min時，蟲草多糖含量呈上升趨勢，120 min時蟲草多糖含量最高為11.8 mg/mL，120 min后蟲草多糖含量隨時間的升高略有下降并逐漸趨于平緩，可能是由于提取時間過長，多糖發生了轉化，含量降低。故浸提時間120 min為宜。

2.2 飲料配方的確定

2.2.1 蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例的確定

蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例試驗結果如圖3所示。

圖3 蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的比例對飲料感官評定的影響Fig.3 Effect of proportion of Cordyceps militaris extract and water or rose water on beverage sensory evaluation

由圖3可知蛹蟲草浸提液與水或玫瑰花水的體積比為2∶1時感官評定均呈現最高值，而玫瑰花水的感官評價明顯優于水，真菌子實體在浸提的過程中會有一些特殊的氣味，這些氣味會影響飲料成品的氣味，添加一定量的玫瑰花水后，玫瑰花水的香味可以掩蓋這些特殊的氣味，使飲料的氣味得到改善，若是玫瑰花水添加太多則會導致蛹蟲草味道被掩蓋，故選取蛹蟲草浸提液與玫瑰花水為2∶1的比例。

2.2.2 玉米肽添加量的確定

玉米肽是以玉米蛋白為原料，利用蛋白酶水解玉米蛋白獲得的產物，不同的蛋白酶和水解條件獲得的玉米肽具有不同的生物活性[17]。玉米肽中富含多種人體必需氨基酸，特殊的氨基酸組成和連接方式賦予玉米肽多種生物活性，如抗疲勞、促進乙醇代謝、抗氧化、降血壓等[5-8]，玉米肽添加量試驗結果如圖4所示。

圖4 玉米肽添加量對飲料感官評定的影響Fig.4 Effect of corn peptides on beverage sensory evaluation

由圖4可知，隨著玉米肽添加量的逐漸增加，感官評分出現先增加后降低的趨勢。玉米肽是玉米蛋白通過蛋白酶水解獲的產物，在水解過程中，玉米蛋白中大量的疏水性氨基酸暴露，導致玉米肽具有一定的苦味，添加到飲料中，會使飲料的口感和氣味有所改變。玉米肽添加量在10 g/L時，感官評定的分數最高，若玉米肽添加量大，苦味也就隨之增大，若玉米肽添加量過少，則飲料的功能性有所降低。故選取玉米肽為10 g/L的添加量。

2.2.3 乙基麥芽酚添加量的確定

乙基麥芽酚是一種安全無毒、用途廣、效果好、用量少的理想食品添加劑，是煙草、食品、飲料、香精、果酒等良好的香味增效劑，常常添加到飲料中，起到掩蔽劑的作用，對食品的香味改善和增強具有顯著效果，且能延長食品儲存期。由于玉米肽的添加，引入了一定的苦味，所以通過添加一定量的乙基麥芽酚來掩蓋苦味。乙基麥芽酚添加量結果如圖5所示。

圖5 乙基麥芽酚的添加量對飲料感官評定的影響Fig.5 Effect of ethyl maltol content on beverage sensory evaluation

由圖5可知，乙基麥芽酚的添加量在1.5 g/L時感官評定的分數最高，乙基麥芽酚添加量過少不能將玉米肽的苦味適度掩蓋；若乙基麥芽酚添加過多，會使飲料中充滿乙基麥芽酚的味道，口感不適，故選取乙基麥芽酚為1.5 g/L的添加量。

2.2.4 蜂蜜添加量的確定

蜂蜜除了富含糖類物質外，還含有少量的維生素、氨基酸、蛋白質、有機酸及多種人體必需的微量元素[18]。此外，蜂蜜中還含有多種酶類物質，主要包含葡萄糖氧化酶、淀粉酶及轉化酶等，其中轉化酶可將蜂蜜中蔗糖轉化為具有旋光性的單糖，即α-果糖和α-葡萄糖[19]。蜂蜜作為甜味劑在賦予飲料甜味的同時，還引入了很多的營養物質，使飲料的營養價值進一步提升。蜂蜜添加量試驗結果如圖6所示。

圖6 蜂蜜添加量對飲料感官評定的影響Fig.6 Effect of honey content on beverage sensory evaluation

由圖6可知，甜味由淡變甜到過甜，感官評分先升高后降低，因此蜂蜜添加量80 g/L為宜。蜂蜜的甜度較大，其用量會直接影響飲料的口感，用量少則飲料沒有甜味或甜味過低，用量多甜味過高，會掩蓋飲料的其他風味。

2.2.5 檸檬酸添加量的確定

檸檬酸是一種食品添加劑，常常作為酸味調節劑添加到食品中。檸檬酸添加量結果如圖7所示。

圖7 檸檬酸的添加量對飲料感官評定的影響Fig.7 Effect of citric acid content on beverage sensory evaluation

由圖7可知，隨著檸檬酸添加量的增加，感官評價分數呈現先升高后降低的趨勢，檸檬酸的添加量在0.15 g/L時為宜，檸檬酸用量會直接影響飲料的風味口感，若用量過少會使飲料失去酸的口感，甜味明顯；若用量過多則會導致飲料太酸，酸味突出，有澀口感，易失去復合飲料的特別風味。故選取檸檬酸添加量0.15 g/L為宜。

2.3 飲料配方的正交試驗優化

在單因素試驗的基礎上，選取蛹蟲草浸提液和玫瑰花水的比例、玉米肽添加量、蜂蜜添加量、檸檬酸添加量為作為考察因素。蛹蟲草玉米肽復合飲料配方優化的正交試驗結果與分析見表3。

由表3可知，影響飲料風味的因素主次順序為玉米肽添加量>蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例>蜂蜜添加量>檸檬酸添加量，即影響最大的是玉米肽添加量，其次是蛹蟲草浸提液與玫瑰花水的比例和蜂蜜添加量，檸檬酸添加量對飲料品質影響最小。由于玉米肽存在苦味，對飲料的影響較大，其他因素對飲料的口感影響較小。根據均值k確定最優的組合為A2B1C2D3，即蛹蟲草浸提液：玫瑰花水=2∶1(mL∶mL)、10 g/L的玉米肽、80 g/L的蜂蜜、0.15 g/L的檸檬酸。按A2B1C2D3條件進行3次平行試驗，感官評價的平均值為94.31，高于表3中每一項試驗結果，故A2B1C2D3為最佳組合。

表3 蛹蟲草玉米肽復合飲料配方正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal test results and analysis of Cordyceps militaris corn peptide compound beverage

2.4 產品質量標準

2.4.1 感官評定

蛹蟲草玉米肽飲料呈淺黃色，無沉淀，溶液澄清透明，具有蛹蟲草獨特的風味(略帶苦味)，酸甜可口，無異味。

2.4.2 理化指標

纖溶酶活力為2.78 U/mL；蟲草素含量為12.43 μg/mL；多糖含量為199 mg/mL。

纖溶酶具有溶解纖維蛋白的能力，而纖維蛋白是血栓的主要成分。在生物化學中，纖維蛋白溶解簡稱為纖溶。血液中存在著凝血系統和纖維蛋白溶解系統，它們各受一系列酶促反應的調節，正常生理狀態下，這兩個系統保持動態平衡，既保證血液有潛在可凝固性，又保證血液的流體狀態。纖溶的生物學作用之一是去除血管、組織液中過剩的纖維蛋白沉積物，以保持血循環、組織液管道等的通暢。人體隨著年齡的增長，或長期飲食習慣不良或飲食結構不當，可使體內纖溶能力逐漸減弱，纖維蛋白就可能積累在血管內，增加血栓傾向[20]。

含纖溶因子的功能性食物具有增加人體纖溶系統活性的功能[21-22]。有計劃地食用含纖溶因子的功能食品，可使體內纖溶系統活性緩慢適量增強，逐漸恢復其正常生理狀態，降低血栓傾向[23-26]。以蛹蟲草子實體為原料研制的飲料具有較好的降低血栓傾向的功效。

蟲草素(cordycepin)是蛹蟲草的一種特殊的腺苷類似物活性物質，具有調節人體免疫、抑制腫瘤生長、抗菌抗病毒、治療白血病和消炎等多種功能[27-30]。

蟲草多糖是蛹蟲草中所含活性物質中最豐富、最重要的物質，具有很高的營養價值和藥效功能，特別是其在抗氧化和提高機體免疫力的功能方面有明顯的效果，除此之外，蟲草多糖還具有降血壓、降血脂、抗腫瘤和保護肝臟等功能[31-34]。

2.5 抗氧化活性

2.5.1 蛹蟲草飲料DPPH·清除能力試驗

DPPH·是一種很穩定的自由基，當樣品中存在清除劑時，其與DPPH中電子配對，使DPPH溶液被吸收而逐漸消失，DPPH溶液褪色程度與配對電子數成化學計量關系，因而可以通過分光光度法進行測定。由于飲料的顏色會對清除率的測定造成影響，故采用不同濃度的Vc溶液做對照。

蛹蟲草飲料與Vc抗氧化活性分析如表4所示，蛹蟲草飲料具有較強的清除DPPH自由基能力，在體積分數為10%時對DPPH·清除率就達到93.6%，與之相比Vc在20 μg/mL時清除率約為95.3%，因此對于DPPH·清除能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc。

2.5.2 蛹蟲草飲料羥自由基(·OH)清除試驗

·OH清除是利用H2O2與Fe2+產生·OH，·OH與水楊酸反應生成2,3-二羥基苯甲酸，若在反應體系中加入具有清除·OH的物質就會減少生成的·OH，通過測定吸光度計算可以得到·OH清除率。

隨著飲料濃度的增加，·OH清除能力逐漸增強，由于飲料濃度的增加，其與羥自由基作用的機會增大，使羥自由基與水楊酸作用的機會降低，從而使2,3-二羥基苯甲酸的生成量降低，清除率上升。蛹蟲草飲料在體積分數為10%時，·OH清除率為39.9%左右，同比Vc清除率在40 μg/mL時達到44.5% 左右。因此對于羥自由基清除能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有40 μg的Vc。

2.5.3 蛹蟲草飲料還原力試驗

飲料中存在的抗氧化劑能使鐵氰化鉀的Fe3+還原成Fe2+，用三氯乙酸與反應后剩余的鐵氰化鉀反應生成沉淀通過離心除去，排除對吸光度數值的影響，Fe2+進一步和FeCl3反應生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍，因此測定700 nm處的吸光度的高低可以間接反映抗氧化劑的還原能力大小，吸光度越大還原能力越強。

隨著蛹蟲草飲料和Vc濃度的增加，吸光值逐漸升高，還原能力逐漸變強，即抗氧化能力越好。蛹蟲草飲料在蛹蟲草浸提液體積分數為10%，還原力為0.774左右，同比Vc清除率在20 μg/mL時達到0.782左右。因此對于還原力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc。

表4 飲料與Vc抗氧化活性分析Table 4 Analysis of antioxidant activities of beverages and Vc

注：Vc質量濃度從左至右依次為20、40、20 μg/mL。

3 結論

本文以蛹蟲草子實體浸提液為原料，通過正交試驗確定蛹蟲草飲料的最佳配比為蛹蟲草浸提液：玫瑰花水(mL∶mL)=2∶1、10 g/L的玉米肽、80 g/L的蜂蜜、0.15 g/L的檸檬酸。此配方條件下，飲料的色澤、口感、氣味等為最佳，感官評價的平均值為94.31；纖溶酶活力為2.78 U/mL；蟲草素含量為12.43 μg/mL；多糖含量為199 mg/mL。對于DPPH·能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc；對于OH·清除能力，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有40 μg的Vc；在Fe3+還原力測定中，每毫升蛹蟲草飲料中約相當于含有20 μg的Vc，具有良好的抗氧化活性。