雷州黑鴨FSHR和ESR1與繁殖性狀關聯分析

鄒坤 崔紅艷 薛緣 張少偉 路麗麗 趙志輝 蘇瑛

（廣東海洋大學農學院，湛江 524088）

早期卵泡的發育在家禽繁殖性狀有著至關重要的作用，它主要受下丘腦-垂體-卵巢軸分泌的激素調控［1］。促卵泡素受體（Follicle stimulating hormone，FSHR）和雌激素受體（Estrogen alpha，ESR1）是卵泡發育的重要激素受體，其表達量高低與家禽產蛋量顯著相關［2］。近些年，針對FSHR在家禽的研究主要集中在雞，研究發現FSHR在雞的表達主要在性腺且初次表達也是在性腺，它是通過介導FSH激活cAMP信號通路促進顆粒細胞分泌促黃體生成素、生長轉化因子（Transforming growth factor，TGF）、雌激素（Estrogen，ES）等激素和生長因子，同時通過信號分子激活TGF-β、ERK以及AKT等信號通路共同作用促進顆粒細胞的增殖，從而促進卵泡的發育和成熟［3］。Xu等［4］發現FSHR的單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）與番鴨的產蛋量顯著相關，且發現番鴨FSHR與雞（93.2%）、綠頭鴨（95.7%）具有高度同源性。ESR1則是一個多功能基因，它表達在動物體內絕大多數組織，且在不同組織中功能也不同。ESR1既可以通過介導ES激活ERK信號通路，調節磷酸化作用增強或抑制功能基因的轉錄，又可以介導Caspase信號通路使細胞分泌腫瘤壞死因子和白細胞介素調控顆粒細胞凋亡或癌變［5-6］。但大量研究表明ESR1在動物卵巢的主要作用是控制動物產仔數和促進性成熟［7-8］。此外，ESR的PvuⅡ多態性與動物的繁殖性狀密切相關［8］。

雷州黑鴨是分布于雷州半島海灘的優質灘涂鴨種，其主要以蝦蟹貝類為食，且具有開產期早（120 d）、產蛋期長（2年）、產蛋量高（280/500 d）、綠殼率高（80%）等特性［9］。通過對其解剖發現其卵巢具有豐富的卵泡（圖1），在繁殖性能具有巨大的開發價值。綜上所述，FSHR和ESR對雷州黑鴨的繁殖性能可能有密切的關系。因此，本研究通過對雷州黑鴨FSHR和ESR1基因在性腺軸的表達規律研究和產蛋關聯分析，旨在揭示2個基因對雷州黑鴨早期性腺的調控機制以及對繁殖性能的影響，為雷州黑鴨分子育種提供靶位點以及為優質種質資源的開發提供理論依據。

圖1 180日齡雷州黑鴨和卵巢組織

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雷州黑鴨由湛江市坡頭區恒成種養合作社提供，所有鴨單籠飼養，飼養水平、大小、體型、世代均一致。隨機挑選25只雷州黑鴨用于采集下丘腦、垂體、卵巢組織測量FSHR和ESR1表達量（0、30、60、90和120 d，每個時期5只），117只飼喂至300 d用于FSHR和ESR1的繁殖性狀關聯分析，統計開產期（FEA）、開產蛋重（FEW）、開產體重（FIW）、120 d產蛋數（120E）、180 d產蛋數（180E）、240 d產蛋數（240E）、300 d產蛋數（300E）及300 d蛋品質測試，指標包括蛋重、蛋形指數、蛋殼強度、哈夫單位、蛋黃重、蛋白重和蛋白高度。在300 d，每個個體采血1 mL用于提取DNA，篩選SNP。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 根據TransZol Up Plus Kit（Trans，廣州）試劑盒分別對 0 d、30 d、60 d、90 d和120 d的下丘腦、垂體、卵巢組織進行總RNA提取。提取的總RNA通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，根據TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（Trans，廣州）試劑盒說明書進行cDNA合成，并將cDNA于-20℃冰箱保存。

1.2.2 引物設計與熒光定量 根據GenBank上的綠頭野鴨的基因序列，用Primer 3.0分別對FSHR（Gene ID：XM_005012095.2）、ESR1（Gene ID：101802318）和 β-actin（Gene ID ：NM_001310421.1）設計引物（表1）。按照ChamQTM SYBR qPCR Master Mix 7750（Trans，廣州）熒光定量試劑盒，在Applied Biosystems StepOnePlus（美國）熒光定量PCR上對0 d、30 d、60 d、90 d和120 d的下丘腦、垂體和卵巢組織進行熒光定量。PCR反應體系 ：10 μL ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（1×），0.4 μL PCR Forward Primer（0.4 μmol/L），0.4 μL PCR Reverse Primer（0.4 μmol/L），0.4 μL ROX Reference Dye（1×），2.0 μL cDNA，6.8 μL ddH2O，總體積 20 μL。反應程序：94℃，35 s；（94℃，20 s；57℃，35 s；采光；72℃，25 s）40個循環；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s。

1.2.3 DNA提取和DNA池構建 根據HiPure Blood DNA Mini Kit（Megen，廣州）試劑盒對117只雷州黑鴨血液DNA進行提取，對提取的DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，以117個雷州黑鴨的DNA作為構建DNA池的樣品。隨機挑選30個樣品進行用于篩選SNP。根據NCBI公布的綠頭野 鴨 FSHR（Gene ID：XM_101800482） 和 ESR1（ENSAPLG00000004585）的外顯子和內含子序列設計PCR引物（表1）。用FSHR和ESR1作為模板，進行PCR反應。反應體系：2 μL cDNA，1 μL正向引物，1 μL 反向引物，25 μL Premix Taq（TaKaRa，大連）和 21 μL dd H2O。反應程序：（98℃，10 s；55℃，30 s；72℃，1 min）30個循環。最終的PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳并測序。

1.2.4 SNP篩選和基因分型 利用DNAMAN對PCR產物測序的序列進行分析比對并篩選SNP位點。根據篩選到的FSHR的兩個突變位點和ESR1的一個位點進行引物設計（表1），然后用PCR-SSCP［10］方法對篩選到的3個SNP位點進行基因分型。在聚丙烯酰胺凝膠上挑選不同類型的條帶進行測序。

1.2.5 數據處理 根據2-ΔΔCT方法處理熒光定量數據。利用一般線性模型對FSHR和ESR1突變基因型進行分析：Yij= μ+Gi+eij（Yij：不同性狀觀測值；μ：總群體平均值；Gi：每個基因型的影響；eij：隨機誤差）。

2 結果

2.1 FSHR和ESR1的表達規律

本研究對雷州黑鴨0 d、30 d、60 d、90 d和120 d的下丘腦、垂體、卵巢組織的FSHR和ESR1進行熒光定量。如圖2所示，FSHR在下丘腦和垂體的表達量在0-90 d呈穩定上升趨勢，在90-120 d下降，90 d表達量最高，且在下丘腦90 d表達量與0 d表達量差異顯著（P＜0.05）；在卵巢0-120 d的表達量總體呈上升趨勢，在120 d表達量達到最高，但與其他時期無顯著差異（P＞0.05）。如圖3所示，ESR1在0-120 d所測組織的表達量存在波動，除90-120 d垂體表達量下降，其總體表達呈上升趨勢。ESR1在下丘腦和卵巢120 d表達量最高，而在垂體90 d表達量最高，在3個組織的最高表達量都與0 d表達量差異顯著（P＜0.05）。

2.2 SNP篩選和基因分型

如圖4所示，FSHR的136 bp（intro1）和66 146 bp（exon6）分別有1個突變位點，分別命名為g.856937G＞A 和 g.922947A＞G；ESR1的 190 744 bp有1個突變位點，命名為g.190744A＞G。g.856937G＞A位點的突變導致原始編碼氨基酸纈氨酸突變為甲硫氨酸，并且g.922947A＞G位點是沉默突變。此外，g.190744A＞G位點的突變導致原始編碼氨基酸脯氨酸突變為異亮氨酸。PCR-SSCP和測序結果顯示，以上3個SNP位點都有3種基因型，分別是AA、AG和GG型，如圖4和圖5。

2.3 FSHR和ESR1多態性

如表2所示，FSHR和ESR的多態性分析顯示3個 SNP位點都呈中度多態性（0.25＜PIC＜0.5），g.856937G＞A 和 g.190744A＞G 處 于 Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05），而 g.922947A＞G 處于 Hardy-Weinberg非平衡狀態（P＜0.05）。此外，3個SNP都具有較高遺傳多態性。

2.4 FSHR和ESR1與繁殖性狀關聯分析

如表3所示，關聯分析顯示，FSHR的2個SNP位點都與雷州黑鴨FEA，FEW和300E顯著相關（P＜0.05），且 g.922947A＞G 位點還與 FIW 顯著相關（P＜0.05）。ESR1的g.190744A＞G位點與雷州黑鴨FEW、FIW和300E顯著相關（P＜0.05），而與FEA相關性不顯著（P＞0.05）。然而，FSHR和ESR1的3個SNP位點與蛋品質相關性不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 FSHR和ESR1表達規律

FSH和ES在卵巢早期發育中起關鍵作用，其作用強度受其相應受體FSHR和ESR1調節。近年來，研究者對FSHR和ESR1進行了廣泛的研究，結果顯示兩種基因幾乎都表達在下丘腦-垂體-性腺軸上，它們早期的表達量對動物的性成熟起決定性作用［5，11］。FSHR 在卵巢通過介導 FSH 加強 cAMPPAK信號通路，并激活ERK等相關通路調節卵巢雌激素、孕酮等激素共同作用卵泡，當FSHR表達量較低時，顆粒細胞與膜細胞之間的營養物質以及信號交換減弱，顆粒細胞自主激活Caspase信號通路，導致卵泡閉鎖［12-14］。本研究表明FSHR在下丘腦-垂體-卵巢軸的表達量隨著雷州黑鴨日齡的增長呈穩定上升趨勢，與王亞男［11］和 Akazome等［12］在雞的研究基本一致，說明FSHR對雷州黑鴨早期發育有重要作用，同時表明雷州黑鴨早期發育較穩定。研究發現FSHR在優勢卵泡表達量顯著高于從屬卵

泡［15］。隨著雷州黑鴨發育成熟，其優勢卵泡數量迅速增加，而FSHR在卵巢的表達量并未出現顯著增長，且在下丘腦和垂體的表達出現略微下降，說明雷州黑鴨發育成熟后卵泡細胞自分泌和旁分泌調節機制較完善，從側面反映出雷州黑鴨在產蛋性能抗逆性較強，具有良好的開發應用價值。

表1 試驗引物序列

圖2 雷州黑鴨FSHR表達規律

圖3 雷州黑鴨ESR1表達規律

圖4 雷州黑鴨FSHR和ESR1突變位點測序圖

ESR1在雷州黑鴨下丘腦-垂體-卵巢軸的表達量也隨著日齡的增長呈上升趨勢，但可能由于作用時間階段不同，其波動趨勢較大，這與Porto［16］在仔鵝中的研究基本一致。據報道，原始卵泡的啟動主要受顆粒細胞分泌細胞因子與卵母細胞上的c-kit受體結合發揮作用，不依賴雌激素的調節［17］。因此，ESR1在0-30 d的表達量較低。30 d后，ESR1的表達量迅速上升。研究發現，30 d后卵泡顆粒細胞層由單層變厚，標志著次級卵泡發育。ESR1可通過介導ES直接激活ERK/MAPK信號通路，也可活化cAMP-PKA途徑使顆粒細胞和膜細胞表面周期蛋白表達量上調，顆粒細胞快速增殖從而促進卵泡的快速發育和成熟［18-19］。因此，雷州黑鴨ESR1表達量在30 d后迅速增長且在120 d卵巢表達量達到最高，說明ESR1對次級卵泡的發育和性成熟具有重要作用。

通過比較FSHR和ESR1的表達規律發現，兩者表達趨勢基本一致，說明2個基因對雷州黑鴨早期性腺發育具有類似作用。在90 d時，FSHR和ESR1在卵巢的表達量出現下調，推測雷州黑鴨在90 d時可能存在一個等級卵泡選擇過程，但其具體機制仍有待進一步研究。

圖6 雷州黑鴨FSHR和ESR1的PCR-SSCP產物測序圖

表2 雷州黑鴨FSHR和ESR1基因型頻率及遺傳多態性

3.2 FSHR和ESR1與繁殖性狀關聯分析

FSHR和ESR1基因是家禽繁殖性狀的關鍵候選基因，其SNP可能對繁殖性狀產生影響。據報道，番鴨FSHR的編碼區中鑒定出4個SNP，并且C320T 和 A227G 位點與產蛋量顯著相關（P＜0.05）［4］。本研究發現雷州黑鴨FSHR存在2個SNP位點，g.856937G＞A與FEA、FEW、300E顯著相關（P＜0.05），g.922947A＞ G與 FEA、FEW、FIW、300E顯 著 相關（P＜0.05）。g.856937G＞A位點導致原始編碼氨基酸纈氨酸突變為甲硫氨酸，g.922947A＞G位點是沉默突變。研究發現，FSHR突變可能通過作用其順式元件影響cFSHR轉錄，其編碼氨基酸突變可影響FSH與FSHR的特異性結合率調節特異性信號通路，從而影響卵泡發育［20-21］。因此，FSHR的SNP對雷州黑鴨繁殖性狀的具有重要作用，且g.856937G＞A和g.922947A＞G位點作為雷州黑鴨產蛋標記基因具有巨大的經濟價值。此外，FSHR在顆粒細胞通常與IGFR結合形成復合受體，其突變可能通過控制胰島素樣生長因子的分泌影響機體生長發育［22-23］，g.922947A＞G與雷州黑鴨FIW顯著相關表明該位點突變可能作用IGF信號通路，但其具體機制有待進一步實驗研究。

表3 FSHR和ESR1的SNP位點與繁殖性狀關聯分析

Niu等［24］發現雞ESR1的外顯子4內的T1101C與30、43、57和66周的產蛋量顯著相關，而與30周的蛋重相關性不顯著（P ＜0.05）。Terman 等［7］發現，ESR的多態性與生產母豬的數量之間存在極大差異（P＜0.01）。本研究發現 ESR1的 g.190744A＞G 位點與雷州黑鴨FEA、FEW、300E顯著相關（P＜0.05），且該位點的突變導致脯氨酸突變為異亮氨酸。以上表明雷州黑鴨ESR1的g.190744A＞G位點可用于產蛋性狀分子標記位點。研究發現，ESR1和ESRβ結構具有高度相似性，二者與雌激素配體結合后發揮不同作用，ESR1在卵巢顆粒細胞膜上可發揮G蛋白偶聯ESR1作用，G蛋白偶聯ESR1可快速介導GDF9和CYP21等非固醇類物質，促進卵泡發育成熟［25］。當ESR1氨基酸突變，可能使其作用途徑發生改變，但其具體結構有待進一步研究。

4 結論

本研究首次對雷州黑鴨早期下丘腦-垂體-卵巢軸的FSHR和ESR1的表達規律進行研究，結果發現，FSHR在雷州黑鴨整個早期性腺發育具有重要作用，ESR1主要作用于雷州黑鴨次級卵泡發育和性成熟，90d時雷州黑鴨可能存在一個等級卵泡選擇的過程。關聯分析發現，本研究鑒定的FSHR和ESR1的3個SNP位點都可作為雷州黑鴨產蛋標記基因，g.922947A＞G可能通過FSHR和IGFR復合受體調節IGF信號通路調節機體生長發育。