低溫脅迫及恢復生長后煙苗葉形指數及生長素的響應

李琦瑤　王樹聲　劉光亮　周培祿　鄭璇　曾文龍　陳志厚　陳愛國

摘要：為研究低溫脅迫及恢復生長后煙苗葉形及生長素含量的動態變化規律，采用盆栽試驗研究4 ℃低溫脅迫下及低溫后恢復常溫生長的煙苗地上部生物量、葉面積、葉形指數、不同部位葉片生長素含量以及生長素外流蛋白家族基因NtPINs表達的變化情況。結果表明，低溫脅迫下煙苗地上部生物量較同期對照組極顯著減小，恢復常溫后雖能繼續生長但生物量仍低于同期對照組;低溫后恢復生長煙苗的葉形指數極顯著高于同期對照組;低溫脅迫24 h時，煙苗莖尖新生葉IAA含量較對照組極顯著升高，但自下而上第4張葉片的IAA含量較對照組極顯著降低，恢復生長8 d時不同部位葉片IAA含量均大幅升高;qRT-PCR結果顯示，低溫脅迫24 h時，煙苗莖尖新生葉NtPIN1、NtPIN1b、NtPIN3、NtPIN3b、NtPIN4和NtPIN9表達水平均較同期對照極顯著下調;低溫下施加外源生長素α-萘乙酸（NAA）、生長素極性運輸抑制劑1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA），常溫下施加NPA可明顯影響煙苗的葉形指數。因此，低溫脅迫導致煙苗地上部生長素從莖尖新生葉向莖基部極性運輸的減少是煙苗葉片形態響應低溫脅迫的生理機制之一。

關鍵詞：煙草;低溫脅迫;葉形指數;生長素;NtPINs基因表達

中圖分類號： S572.01? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0060-06

收稿日期：2018-04-24

煙草是原產于亞熱帶的喜溫作物，早春季節的低溫冷害是我國福建、江西等地南方煙區在移栽期常見的問題之一，易導致煙苗在大田前期生長遲緩、早花和葉形狹長等現象[1]。葉片是煙草最主要的商品器官，其發育情況在很大程度上決定著煙葉的產量和品質。葉形態是植株形態建成的重要組成部分[2]，葉在空間三維軸向上的極性包括基-頂軸、中-側軸和背-腹軸[3]，而葉在基-頂軸和中-側軸2個軸向上的協調生長，決定了葉具有一定的葉形指數（長/寬）[4]。植物受到低溫等逆境脅迫時，會通過激素調節引發相關生理反應來適應環境[5]。生長素（IAA）是最早被發現的一類植物激素[6]，其分布、極性運輸和信號轉導對植物葉片發育及形態建成具有重要的調節作用[7]。李林川等研究發現，生長素極性運輸在葉片形態發生和兩側對稱性生長中具有重要作用[8];用生長素極性運輸抑制劑處理局部葉片，可導致該部位生長素含量升高，葉脈發達，可見生長素的極性運輸與微管組織分化密切相關，進而影響葉片脈型[9]。此外，IAA還可以誘導一些抗寒基因的快速表達。因此也有研究認為，生長素代謝屬于植物抗寒調控系統的一部分[10]。

如上所述，生長素極性運輸對植物葉片形態具有非常重要的作用。Fujino等發現，水稻突變體中生長素含量的變化最終導致窄葉突變性狀的出現[11]，在已克隆的3個窄葉基因NAL7、NAL1和NRL1中，NAL7、NAL1分別涉及生長素的生物合成、極性運輸;而NRL1則通過調控葉片維管組織的發育影響葉片寬度。當前的研究認為，生長素參與煙苗非生物脅迫主要與煙草根系生長有關[12-13]，而關于葉形變化與生長素關系的研究未見報道，外源生長素及生長素極性運輸抑制劑對葉形的影響也尚不清楚。因此，本試驗以我國主栽品種同時也是低溫敏感型品種K326為材料[14]，研究低溫脅迫及恢復生長后煙苗地上部生物量、葉面積、葉形指數、不同部位葉片生長素含量及NtPINs家族基因表達的變化情況，分析不同濃度外源生長素 α- 萘乙酸（NAA）和生長素極性運輸抑制劑1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA）處理下煙苗葉形的變化規律，旨在揭示苗期煙草葉形發育對低溫脅迫的響應機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為K326，由國家農作物種質資源平臺煙草種質資源子平臺（中國農業科學院煙草研究所）提供。

1.2 試驗設計

試驗于2018年1—4月在中國農業科學院煙草研究所青島試驗基地進行。挑選顆粒飽滿的種子，用水浸泡后，用70%乙醇消毒5 min，用水沖洗后在水中浸泡24 h，然后播種于裝有由草炭和蛭石（體積比為1 ∶ 1）混勻后組成的育苗基質的育苗盤中，播種后將其置于溫室內，自然光照，每天澆水，待幼苗出土后，將幼苗移栽至裝有相同基質的假植盤中繼續生長。選取假植盤中長勢一致的7葉苗齡煙苗移栽至裝有等量基質的營養缽（上口內徑為8 cm，底部內徑為6 cm，高度為10 cm，缽底有孔）中，置于晝夜時段各12 h（晝：08：00—19：59;夜：20：00 —次日07：59），溫度為（25±1） ℃的人工智能氣候箱（SPX-250B-G，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）中還苗2 d。設置如表1所示的處理。

表1中的低溫處理時間由筆者所在課題組前期研究低溫脅迫對煙苗葉形的影響時篩選確定[15]。各處理設3次重復，每次重復選取長勢一致且葉片大小相近的煙苗5株，用于地上部生物量、葉形指標、生長素含量的測定以及NtPINs家族基因表達的定量分析。

為研究生長素對煙苗葉形的影響，采用葉面噴施法篩選合適的NAA、NPA濃度，分別對25、4 ℃處理24 h后的煙苗進行外源NAA、NPA噴施。配制100、200、500、1 000 nmol/L NAA（1 mol/L NaOH溶解），對4 ℃處理24 h后恢復到常溫生長的煙苗于次日08：00利用小型噴霧器均勻噴施，以葉面掛有水珠為度，每2 d噴1次;配制150、300、600、1 200 nmol/L NPA（二甲基亞砜溶解），對25 ℃處理24 h后的煙苗于相同時間噴施。每個噴施濃度設3次重復，每次重復選取長勢一致且葉片大小相近的煙苗5株，8 d后記錄自下而上第4張葉片的葉長、葉寬，計算葉形指數（葉長/葉寬），確定外施NAA和NPA的適宜噴施濃度。利用篩選出的適宜噴施濃度，以25 ℃處理24 h后噴施等量去離子水的煙苗為對照，對25 ℃處理24 h后的煙苗分別噴施NAA、NPA，對 4 ℃ 處理24 h后的煙苗分別噴施NAA、NPA，8 d后記錄自下而上第4張葉片的葉長、葉寬，計算葉形指數。每個處理設3次重復，每次重復選取長勢一致且葉片大小相近的煙苗5株。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 地上部生物量的測定 地上部生物量的測定參考趙永長等的方法[16]，用蒸餾水將植株沖洗干凈，擦干后剪取地上部，稱其鮮質量，然后于105 ℃條件下殺青15 min，75 ℃條件下烘至恒質量，稱其干質量。

1.3.2 葉形指數和葉面積的測量 測量自下而上第4張葉片的葉長、葉寬，計算葉面積（葉長×葉寬×0.634 5）和葉形指數（葉長/葉寬）。測量方法參考YC/T 142—2010《煙草農藝性狀調查測量方法》。

1.3.3 生長素含量測定 生長素含量測定參考Song等的方法[17]，采集各處理莖尖新生葉和自下而上第4張葉片（靠近主脈附近）各0.1 g，放入液氮中速凍。將樣品放置于液氮預冷的研缽中，快速研磨至粉末后，加入80%甲醇繼續研磨，將研磨后的樣品轉移至50 mL離心管中，加入少量80%甲醇沖洗研缽，定容至20 mL，4 ℃浸提過夜。8 000 r/min、4 ℃離心10 min后取出上清液，向殘渣中加入0.5 mL 80%甲醇繼續浸提3 h，重復上述操作，合并2次上清液。用氮吹儀濃縮至05 mL左右，加入0.5 mL石油醚，振蕩混勻，移去上層醚相，保留下層水相，重復上述操作3次。向下層水相中加入 1 mol/L HCl將pH值調至2.5左右，加入等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取后的乙酸乙酯層，用氮吹儀吹干，用流動相（100%甲醇：1%乙酸體積比為4 ∶ 6）定容至0.5 mL，然后用針頭式過濾器將其過濾于帶有內襯管的樣品瓶內待測。儀器設置條件：Rigol L3000高效液相色譜儀，Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），KQ2200DE數控超聲波清洗器，吲哚乙酸（IAA）標準品（購自Sigma公司）。

1.3.4 NtPINs家族基因的引物設計及qRT-PCR分析 另取各處理的莖尖新生葉于液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。總RNA的提取采用Trizol法，cDNA合成采用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒[18]，以不同處理后的樣品逆轉錄cDNA稀釋5倍后為模板，各基因的相對表達水平采用2-ΔΔCT方法[19]進行定量分析。qRT-PCR反應程序為預變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環反應40次;熔解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。內參NtActin[19]及NtPINs家族基因引物序列見表2[20]，引物由睿博興科生物技術有限公司合成。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2013和SAS 9.4對數據進行處理、統計分析及圖形制作。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫及恢復生長后煙苗地上部生物量的變化

從圖1可以看出，處理12、24 h時，處理組煙苗地上部鮮質量較同期對照組極顯著降低（P<0.01）;處理3、9 d時，對照組地上部鮮質量和干質量開始增大，而處理組雖較低溫脅迫階段有所增大但仍低于同期對照組，處理9 d時，對照組和處理組地上部鮮質量的差值較處理3 d時進一步增大;煙苗地上部干質量的變化趨勢與鮮質量相似，同樣在低溫后恢復生長階段，處理組地上部干質量與同期對照組的差值逐漸增大。

2.2 低溫脅迫及恢復生長后煙苗葉面積和葉形指數的變化

從表3可以看出，處理12、24 h時，對照組和處理組葉長和葉寬變化不大，但隨著處理時間的延長，對照組葉長和葉寬開始明顯增大，而處理組增幅較小。當處理3、9 d時，處理組葉長顯著小于同期對照組（P<0.05），葉寬極顯著小于同期對照組（P<0.01）。

從圖2可以看出，處理12、24 h時，對照組和處理組葉面積均未發生明顯變化。處理9 d時，對照組葉面積快速增大，而處理組葉面積雖有所增大， 但增大后的葉面積極顯著低于同期對照組（P<0.01）;低溫后恢復生長階段，處理組葉形指數開始增大，處理3、9 d時葉形指數均極顯著高于同期對照組（P<0.01）。結合葉長、葉寬數據的變化規律，葉形指數的增大主要在于葉寬生長受抑制程度大于葉長生長受抑制程度，從而表現為葉形狹長。

2.3 低溫脅迫及恢復生長后煙苗不同部位葉片IAA含量的變化

從圖3可以看出，處理12、24 h時，對照組莖尖新生葉IAA含量無明顯變化，而處理組莖尖新生葉在低溫脅迫24 h時IAA含量大幅升高，升高后的IAA含量極顯著高于同期對照組（P<0.01）。處理9 d時對照組和處理組莖尖新生葉IAA含量均大幅升高，但此時處理組與同期對照組IAA含量無顯著差異。處理12、24 h時，處理組自下而上第4張葉片IAA 含量極顯著低于同期對照組（P<0.01）。 處理9 d時對照組和處理組自下而上第4張葉片IAA含量同樣大幅升高，處理組與同期對照組無顯著性差異。

2.4 低溫脅迫及恢復生長后煙苗NtPINs家族基因表達量的變化

通過qRT-PCR研究NtPINs家族基因的相對表達量。從圖4可以看出，煙苗莖尖新生葉中NtPINs家族基因（NtPIN1、NtPIN1b、NtPIN3、NtPIN3b、NtPIN4和NtPIN9）的表達量呈現出不同的變化趨勢。處理12 h時，處理組除NtPIN4之外，其余基因的表達水平均較同期對照組極顯著下調（P<0.01）。處理24 h時，處理組各基因表達水平繼續下調。處理3 d時，處理組僅NtPIN4基因表達水平繼續下調，其余基因的表達水平均有所上調;在5個上調基因中，除NtPIN3b外，其余4個基因的表達水平仍極顯著低于同期對照組（P<0.01）。處理9 d時，除NtPIN3外，其余5個基因的表達水平仍顯著或極顯著低于同期對照組。

2.5 外源NAA、NPA濃度對煙苗葉形指數的影響

本試驗對4 ℃低溫處理24 h后的煙苗噴施系列濃度NAA進行濃度篩選，結果（圖5-A）發現，隨著NAA濃度從100 nmol/L增加到1 000 nmol/L，煙苗自下而上第4張葉片的葉形指數呈遞減趨勢，當NAA濃度為500 nmol/L時，低溫脅迫后恢復生長煙苗的葉形指數與25 ℃對照組相當，因此在本試驗條件下，把NAA的適宜噴施濃度確定為500 nmol/L。對25 ℃處理24 h后的煙苗施加系列濃度NPA進行濃度篩選，結果（圖5-B）發現，NPA濃度從150 nmol/L增加到 1 200 nmol/L，葉形指數呈遞增趨勢，當NPA濃度為 600 nmol/L 時，常溫生長下煙苗葉形指數與4 ℃對照組葉形指數相當，因此在本試驗條件下，把NPA的適宜噴施濃度確定為600 nmol/L。從圖5-C可以看出，25 ℃處理后噴施 500 nmol/L NAA煙苗的葉形指數與對照組（25 ℃處理后噴施去離子水）無明顯差異，噴施600 nmol/L NPA煙苗的葉形指數極顯著增大（P<0.01）;4 ℃處理后噴施NAA煙苗的葉形指數與對照（25 ℃去離子水處理）無明顯差異，而噴施NPA煙苗的葉形指數極顯著增大（P<0.01）。

3 討論

葉片是煙草最重要的商品器官，其能通過光合作用提供煙株生長發育所需要的能量，同時儲存有機物和礦質營養[2]。研究證明，葉片發育受體內遺傳機制和體外環境因子的雙重調節[8]。本研究中，常溫生長的煙苗葉形指數在生長過程中未發生明顯變化，但低溫后恢復生長的煙苗葉形指數較對照組極顯著增大，主要在于低溫對葉寬生長的抑制作用強于對葉長生長的抑制作用，說明短期的極端低溫（4 ℃）對葉片中-側軸的影響大于基-頂軸，葉寬生長停滯的響應早于葉長，這與前人研究常態低溫（10 ℃）對紅花大金元、云煙87等煙草品種葉形影響的結果[21]一致。葉片中-側軸的發育是指葉片沿中脈向兩側發育，即葉片的水平擴展，中間部分主要由中脈構成，而側邊部分主要由葉肉和次級脈構成[22]。此前已在擬南芥上發現，ANGUSTIFOLIA[23]和SPIKE1[24]通過影響細胞在中-側軸方向上的極性擴展來調控葉片的寬度，而ANGUSTIFOLIA3[25]則通過調控中-側軸方向上的細胞數量影響葉片的寬度，但煙草上是否也存在類似的調控因子，通過低溫誘導其表達進而影響葉寬還有待進一步研究。

生長素的分布、極性運輸和信號轉導對植物葉片發育和形態建成具有重要的調節作用[26]。Wang等研究發現，生長素主要在植物根尖、莖尖、幼葉和發育中的種子等生長活躍的地方合成，然后再運輸到其他部位發揮作用[27]。本研究分別測定生長素合成部位莖尖新生葉和煙苗自下而上第4張葉片中的IAA含量，結果發現，低溫脅迫12 h時，處理組莖尖新生葉IAA含量略有降低，說明低溫對莖尖新生葉的生長素合成有一定的抑制作用，這與低溫下煙苗生長緩慢，頂端優勢較弱等苗相表現一致;但低溫脅迫24 h時，IAA含量明顯升高，其原因可能與該時期煙苗頂芽生長發育狀態的轉變有關[14]。筆者所在課題組前期試驗發現，低溫后恢復常溫生長的煙苗植株形態在2 d內就能恢復正常[15]，而本試驗發現，處理9 d時，處理組煙苗的莖尖新生葉IAA含量大幅升高，說明此時可能是煙苗轉向快速生長的關鍵時期[14]。生長素的極性運輸可分為向頂運輸和向基運輸2種方式。在莖中，由莖尖生長素合成點向莖基部運輸，即從形態學的頂端向基部運輸，屬于向基運輸[28]。生長素在植物體內的流動是通過極性運輸完成的，低溫的作用主要是影響生長素的極性運輸而不是生長素信號的傳導[8]。李靜等研究發現，低溫影響生長素的極性運輸和側向運輸，而高溫影響生長素的生物合成[6]。本試驗中，處理12、24 h時，處理組自下而上第4張葉片中IAA含量較同期對照組顯著降低，說明低溫影響煙苗地上部IAA的極性運輸，這與Shibasaki等的研究結果[29]一致。此外，生長素外流運輸蛋白基因家族PINs的不對稱分布決定了生長素的極性運輸[30]。本試驗中，處理24 h時，處理組葉片NtPIN1、NtPIN1b、NtPIN3、NtPIN3b、NtPIN4和NtPIN9均較同期對照組極顯著下調，處理9 d時，除NtPIN3基因外，其余各基因的表達水平均仍顯著或極顯著低于同期對照，說明低溫對7葉苗齡煙苗生長素外流蛋白基因表達的抑制在恢復生長的短時間內不會恢復。不同基因在低溫脅迫階段及恢復生長后的表達模式各不相同，其分子機制有待進一步研究。

Leyser等研究認為，生長素供給、極性運輸及葉片微管發育之間聯系緊密，微管模式與生長素極性運輸之間通過一個正反饋環相聯系[31]。本研究中，低溫脅迫后外施NAA可有效緩解葉片狹長的趨勢，而常溫下外施NPA則造成葉片橫向生長受阻，葉形呈狹長生長。由于低溫脅迫下葉寬生長較葉長生長受到的抑制程度更大，且低溫主要影響莖部生長素的極性運輸，推測NPA通過與生長素輸出復合體結合，特異性地阻斷莖尖合成的生長素向下極性運輸，抑制PIN蛋白從膜內到質膜的移動[32]。Scarpella等研究發現，生長素極性運輸抑制劑處理植物會使該部位葉脈異常發達，而其他部位則因沒有生長素的輸入而導致葉脈退化或不明顯[33]，進一步證明生長素的極性運輸與維管組織發育關系緊密，從而影響葉片形態。常溫條件下施加外源生長素，葉形指數并未發生明顯變化，說明單就生長素而言，植物葉形是生長素供應、生長素輸入輸出及生長素信號轉導等多方面協同作用的結果。

4 結論

低溫脅迫后恢復生長的煙苗，與同期對照組相比，地上部生物量、葉面積減小，葉形指數增大，葉形狹長;低溫脅迫抑制煙苗葉片生長素由莖尖新生葉向莖基部的極性運輸，外源生長素極性運輸抑制劑NPA可調節煙苗的葉形指數，外源生長素NAA可有效緩解低溫造成煙苗葉形狹長的趨勢;低溫脅迫下莖尖新生葉生長素外流蛋白家族基因NtPINs表達量整體顯著降低。因此推斷，低溫脅迫導致煙苗地上部生長素從莖尖新生葉向莖基部極性運輸的減少是煙苗葉片形態響應低溫脅迫的生理機制之一。

參考文獻：

[1]胡日生，曾 中，戴杏華，等. 不同耐性煙草品種苗期葉片光合特性對低溫脅迫的響應[J]. 中國農學通報，2013，29（34）：71-75.

[2]崔曉峰，黃 海. 葉發育的遺傳調控機理研究進展[J]. 植物生理學報，2011，47（7）：631-640.

[3]Bowman J L，Eshed Y，Baum S F. Establishment of polarity in angiosperm lateral organs[J]. Trends in Genetics，2002，18（3）：134-141.

[4]Tsukaya H. Mechanism of leaf-shape determination[J]. Annual Review of Plant Biology，2006，57：477-496.

[5]田小霞，孟 林，毛培春，等. 低溫條件下不同抗寒性薰衣草內源激素的變化[J]. 植物生理學報，2014（11）：1669-1674.

[6]李 靜，崔繼哲，弭曉菊. 生長素與植物逆境脅迫關系的研究進展[J]. 生物技術通報，2012（6）：13-17.

[7]Tsukaya H. Leaf morphogenesis：genetic regulations for length，width and size of leaves[J]. Tanpakushitsu Kakusan koso. Protein，Nucleic Acid，Enzyme，2002，47（12）：1576-1580.

[8]李林川，瞿禮嘉. 生長素對擬南芥葉片發育調控的研究進展[J]. 植物學通報，2006，23（5）：459-465.

[9]王 豐，程方民. 生長素對植物維管分化的信號誘導作用[J]. 江蘇林業科技，2004，31（1）：40-44.

[10]任怡怡，戴紹軍，劉 煒. 生長素的運輸及其在信號轉導及植物發育中的作用[J]. 生物技術通報，2012（3）：9-16.

[11]Fujino K，Matsuda Y，Ozawa K，et al. NARROW LEAF 7 controls leaf shape mediated by auxin in rice[J]. Molecular Genetics and Genomics，2008，279（5）：499-507.

[12]趙 陽，王樹聲，張亞麗，等. 增加煙草一級和二級側根是抵御干旱的生理機制[J]. 植物營養與肥料學報，2017，23（2）：548-555.

[13]劉尚俊. 生長素參與鉀脅迫下煙草側根生長發育機制研究[D]. 南京：南京農業大學，2015.

[14]韓錦峰，岳彩鵬，劉華山，等. 烤煙生長發育的低溫誘導研究 Ⅰ. 苗期低溫誘導對烤煙頂芽發育及激素含量的影響[J]. 中國煙草學報，2002，8（1）：25-29.

[15]李琦瑤，王樹聲，周培祿，等. 低溫脅迫對煙苗葉形及生理特性的影響[J]. 中國煙草科學，2018，39（1）：17-23.

[16]趙永長，宋文靜，邱春麗，等. 黃腐酸鉀對滲透脅迫下烤煙幼苗生長和光合熒光特性的影響[J]. 中國煙草學報，2016，22（4）：98-106.

[17]Song W J，Sun H W，Li J，et al. Auxin distribution is differentially affected by nitrate in roots of two rice cultivars differing in responsiveness to nitrogen[J]. Annals of Botany，2013，112（7）：1383-1393.

[18]潘孝武，黎用朝，李小湘，等. CBF調節子在水稻品種日本晴和93-11低溫馴化過程中的差異調控機制[J]. 中國水稻科學，2012，26（5）：521-528.

[19]Li R Y，Ul-Islam S，Wu Z J，et al. Bensulfuron-methyl treatment of soil affects the infestation of whitefly，aphid，and Tobacco Mosaic virus on Nicotiana tabacum[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1970.

[20]Meng L，Song W J，Liu S J，et al. Light quality regulates lateral root development in tobacco seedlings by shifting auxin distributions[J]. Journal of Plant Growth Regulation，2015，34（3）：574-583.

[21]黃 璇. 夜間低溫和短時高溫對不同烤煙品種生長影響的研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2014.

[22]徐 靜，王 莉，錢 前，等. 水稻葉片形態建成分子調控機制研究進展[J]. 作物學報，2013，39（5）：767-774.

[23]Kim G，Shoda K，Tsuge T，et al. The ANGUSTIFOLIA gene of Arabidopsis，a plant CtBP gene，regulates leaf cell expansion，the arrangement of cortical microtubules in leaf cells and expression of a gene involved in cell-wall formation[J]. EMBO Journal，2002，21（6）：1267-1279.

[24]Qiu J L，Jilk R，Marks M D，et al. The Arabidopsis SPIKE1 gene is required for normal cell shape control and tissue development[J]. Plant Cell，2002，14（1）：101-118.

[25]Horiguchi G，Kim G T，Tsukaya H. The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regulate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，2005，43（1）：68-78.

[26]Himanen K，Adem D，Lijsebettens V. Genetic and epigenetic control of leaf size and shape[J]. International Journal of Developmental Biology，2007，1（2）：226-238.

[27]Wang Q N，An B，Wei Y X，et al. Melatonin regulates root meristem by repressing auxin synthesis and polar auxin transport in Arabidopsis[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1882.

[28]Shi J M，Dong J Q，Xue J，et al. Model for the role of auxin polar transport in patterning of the leaf adaxial-abaxial axis[J]. Plant Journal，2017，92（3）：469-480.

[29]Shibasaki K，Uemura M，Tsurumi S，et al. Auxin response in Arabidopsis under cold stress：underlying molecular mechanisms[J]. Plant Cell，2009，21（12）：3823-3838.

[30]Dharmasiri S，Swarup R，Mockaitis K，et al. AXR4 is required for localization of the auxin influx facilitator AUX1[J]. Science，2006，312（5777）：1218-1220.

[31]Leyser O，Day S. Mechanisms in plant development[M]. Blackwell：Oxford，2003.

[32]Friml J. Subcellular trafficking of PIN auxin efflux carriers in auxin transport[J]. European Journal of Cell Biology，2010，89（2/3）：231-235.

[33]Scarpella E，Barkoulas M，Tsiantis M. Control of leaf and vein development by auxin[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2010，2（1）：137-153.熊 偉，楊虹琦，王正華，等. 不同光照度與光照時數對培育烤煙壯苗的影響[J]. 江蘇農業科學，2019，47（3）：66-70.