寬譜噬菌體NTHP01的生理特征及噬菌作用

呂孫建　袁雪梅　劉莉　盧淑娟　杭小英　施偉達

摘要：針對1株從中華鱉養殖塘中分離得到的寬譜噬菌體NTHP01（保藏號：CGMCC No. 9623），對其感染復數、潛伏期和裂解期、熱穩定性、pH穩定性等理化特性展開研究，探討了氯化鎂促噬菌體感染的最佳濃度，并考察了該噬菌體的噬菌譜。結果顯示，噬菌體NTHP01的最佳感染復數為0.01，潛伏期和裂解期分別為150、60 min，最適溫度為 30 ℃，最適pH值為7，氯化鎂終濃度為4 mmol/L時對噬菌體的感染促進作用最佳。此外，結果顯示噬菌體NTHP01宿主范圍寬，能夠有效抑制來自不同水產養殖品種的細菌，包括嗜水氣單胞菌、腦膜膿毒性黃桿菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血性弧菌、維氏氣單胞菌、腐敗希瓦菌、溫和氣單胞菌等。研究結果為噬菌體NTHP01的規模化制備及今后在水產養殖細菌性病害防治中的應用奠定了良好基礎。

關鍵詞：噬菌體;生理特征;抑菌作用;宿主范圍

中圖分類號： S947.1+2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0132-03

細菌性病害是水產養殖的常見病害，長期以來，抗生素在水產養殖病害防治中發揮著重要作用，但由此引發的耐藥菌增加、藥物殘留、水體環境生態問題等不良后果[1-2]，已引起社會的廣泛關注，無抗生素養殖的技術支撐需求凸顯。噬菌體作為天然的生物抗菌制劑，具有見效快、無毒害、無污染等特點，可能替代抗生素在水產養殖細菌性病害防治方面發揮重要作用。噬菌體是一種以細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物作為宿主的病毒，因此在許多細菌聚集的區域都能找到噬菌體，它能夠特異性地殺死宿主菌，達到預防和治療的目的。噬菌體作為細菌性病害控制的方法之一，相關研究已在醫學、畜牧及水產養殖等領域被關注和重視。2005年，Bruttin和Brussow[3]臨床試驗驗證了噬菌體在使用、治療過程中的安全性。目前，已有的文獻報道發現噬菌體對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[4]、沙門氏菌（Salmonella）[5]、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[6]等細菌均有較好的抑制效果。

本實驗室從中華鱉養殖塘中分離純化獲得1株噬菌體NTHP01（保藏號：CGMCC No. 9623），前期研究發現對中華鱉一些細菌性病害有較好的防治作用。為進一步拓展該噬菌體在水產養殖中的應用，本研究對該噬菌體最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）、潛伏期、暴發期、熱穩定性、pH穩定性等理化特性進行測定，同時還探討了陽離子化合物氯化鎂促進噬菌體感染的最佳濃度，以及噬菌體對水產養殖常見致病菌的抑菌效果，為后續規模化生產并應用于水產養殖病害防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗所用嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、腦膜膿毒性金黃桿菌（Elizabethkingia meningoseptic）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）分離自中華鱉養殖池，副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）分離自南美白對蝦養殖池，腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）分離自紅螯螯蝦養殖池，溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）分離自鱸魚養殖池，試驗用細菌均保存于浙江省淡水水產研究所。

1.1.2 培養基 噬菌體培養按試驗內容不同分別采用TSB液體培養基（青島高科園海博生物技術有限公司）、固體培養基（瓊脂濃度為2%）和半固體培養基（瓊脂濃度為1.2%）進行培養。

1.2 方法

1.2.1 最適感染復數（MOI）測定 感染復數（multiplicity of infection，MOI）是指感染時噬菌體與指示菌數量的比值。將已知濃度噬菌體稀釋至1×108 PFU/mL，再進行10倍梯度分別稀釋至1×107、1×106、1×105 PFU/mL;同時將宿主菌（維氏氣單胞菌）搖至1×108 CFU/mL，同樣稀釋至1×107、1×106、1×105 CFU/mL。按表1進行7個不同MOI（1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001）各取100 μL在 1.5 mL Eppendorf管中混合，再加入800 μL新鮮TSB培養液，28 ℃培養3.5 h。取出后分別測定各管中噬菌體效價，3.5 h 滴度最高所對應的MOI即為最適感染復數。

1.2.2 一步生長曲線測定 將噬菌體按最適MOI與宿主菌（維氏氣單胞菌）按1 ∶ 1混合，置于28 ℃培養箱溫育吸附 15 min 后，12 000 r/min離心1 min，去除上清。獲得的沉淀用20 mL 28 ℃預熱的TSB液體培養基重懸，于28 ℃ 120 r/min 振蕩培養。每隔5 min取樣1次，25 min之后每隔15 min取樣，連續取樣3.5 h，在4.5 h時最后取1次。每次取500 μL，使用0.45 μm濾膜過濾后獲得的濾液采用雙層瓊脂培養法測定噬菌體效價。以培養時間為橫坐標、噬菌體滴度為縱坐標，繪制一步生長曲線。

1.2.3 熱穩定性測定 將噬菌體原液稀釋至5×107 PFU/mL 并分裝于2 mL離心管中，分別放置于30、40、50、60 ℃的恒溫水浴鍋中，每隔20 min測定各管噬菌體的滴度，至100 min停止檢測，測定噬菌體的耐受溫度和耐受時間。

1.2.4 pH值穩定性 以TSB培養液為介質，調節pH值為4、5、6、7、8、9、10、11。取滴度為5×108 PFU/mL的噬菌體原液100 μL，加入到900 μL不同pH值的TSB培養液中，28 ℃水浴2 h后測定各管噬菌體的滴度，并計算噬菌體的最適pH值范圍。

1.2.5 氯化鎂促進噬菌體感染的最佳濃度 在各10 mL培養基中加入100 μL宿主菌（維氏氣單胞菌）1×108 CFU/mL，37 ℃搖床培養3 h。然后加入1×108 PFU/mL的噬菌體原液100 μL，及不同終濃度氯化鎂（0、2、4、8、16、32 mmol/L），作用30 min后置于37 ℃搖床培養4 h，取出后分別測定各管中噬菌體效價。

1.2.6 噬菌體對水產養殖病原菌的噬菌作用 采用滴注法觀察噬菌體的噬菌效果。滴注法是首先配制2% TSB瓊脂培養基融化后鋪平培養皿底層，凝固后為固體培養基。用涂布法將宿主菌涂滿這個平板，待平板表面風干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌體液，28 ℃培養過夜，觀察噬菌效果。

2 結果與分析

2.1 最適感染復數（MOI）

取不同感染復數的噬菌體和維氏氣單胞菌，MOI分別為1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001，培養3.5 h后測得相應的噬菌體滴度。結果顯示，該噬菌體感染復數為1、10、100、1 000、0.001時，噬菌體滴度較低，在0.1、0.01時，噬菌體滴度較高（圖1），表明NTHP01對于維氏氣單胞菌的最適感染復數為0.01。

2.2 一步生長曲線

按最適感染復數0.01將噬菌體與維氏氣單胞菌混合，通過離心、沉淀、振蕩培養等操作后，取樣4.5 h，采用雙層瓊脂培養法測定濾液中噬菌體效價，獲得的一步生長曲線（圖2）。結果顯示，該噬菌體在前150 min未有明顯增長，而在 150 min 開始至210 min爆發性增加，之后進入了平穩期。結果表明，噬菌體NTPH01對于維氏氣單胞菌的潛伏期和裂解期分別為150、60 min。

2.3 熱穩定性

對不同溫度下作用時間與噬菌體滴度的常用對數作圖。結果（圖3）顯示，該噬菌體在30～40 ℃區間內，噬菌體滴度均在106 PFU/mL以上，相比較原始滴度107 PFU/mL并未明顯降低，整體上存活率高。溫度達到50 ℃及以上時，該噬菌體在20 min內快速失活，20 min時滴度只有105 PFU/mL，當時間在100 min時，50 ℃噬菌體滴度僅為104 PFU/mL，大部分死亡，表現出該噬菌體對50 ℃以上的溫度高度敏感，活性較低。

2.4 pH穩定性

噬菌體NTHP01在pH值為7～10的條件下，滴度保持在107 PFU/mL以上，與初始滴度保持一致，即噬菌體在此pH值區間保持較高的生物活性（圖4），且在pH值為7時活性最高。pH值小于7或大于10時，隨著酸性或堿性增強，噬菌體活性逐漸下降，但總體還保持著較好的活性。

2.5 氯化鎂促進對噬菌體感染的最佳濃度

不同濃度氯化鎂對噬菌體感染影響的結果顯示，添加氯化鎂的噬菌體滴度明顯高于未添加，且在氯化鎂終濃度為 4 mmol/L 時，促進噬菌體對宿主菌的感染作用最佳（圖5）。在氯化鎂終濃度低于4 mmol/L，隨著氯化鎂濃度的增加而增高;當加入的氯化鎂終濃度大于4 mmol/L時，隨著氯化鎂濃度的增加，促進作用減弱。

2.6 噬菌體對水產養殖病原菌的噬菌作用

針對水產養殖中常見的致病菌進行噬菌體噬菌試驗，結果表明，噬菌體NTHP01對大多數常見的病原菌均具有較好的裂解作用（表2）。由圖6-A和圖6-B可知，溫和氣單胞菌和腐敗希瓦菌滴加噬菌體后，可見明顯的噬菌斑，說明該噬菌體對這些細菌均有較好的裂解效果。

3 討論

本研究測定了噬菌體NTHP01的最適感染復數為0.01，潛伏期和暴發期分別為150、60 min，為后續噬菌體的大量制備提供了理論數據基礎。目前，水產養殖水體的一般溫度在20～40 ℃ 之間，呈弱堿性。對該噬菌體熱穩定性及pH值穩定性進行了試驗，發現該噬菌體在30～40 ℃之間內能夠保持較好的穩定性及活性，并在酸堿環境中表現出較好的適應性。

該研究表明，噬菌體NTHP01可以很好地適應水產養殖環境，在水產養殖中應用具有極大的可能性。

噬菌體作為細菌的天敵，具有見效快、無毒害、無污染的特點，受到人們的高度關注[7]。1999年，Nakai等通過黃尾魚的對照實驗研究發現口服或者注射PLgY-16噬菌體可以有效提高黃尾魚的存活率[8]。2003年，Park等在噬菌體治療試驗中，分別給香魚飼喂含變形假單胞菌飼料（107 CFU/尾），然后喂分別含有PPpW-3、PPpW-4、PPpW-3/W-4噬菌體的飼料（107 CFU/尾），發現死亡率分別為53.3%、40.0%、20.0%，而對照組死亡率為93.3%，表明PPpW-3/W-4噬菌體能夠有效地降低由變形假單胞菌引起的魚類病變、死亡[9]。2007年，Karunasagar等從牡蠣組織和蝦孵化場分離出4個噬菌體，對其中2個進一步研究發現可以有效降低哈維氏菌群。在孵化場試驗中，2×106 PFU/mL的噬菌體處理可以使蝦幼蟲存活率超過85%[10]。2013年，Jun等分離出pAh1-C和pAh6-C這2株噬菌體，發現對魚類致病性嗜水氣單胞菌均顯示出有效的溶菌活性，并且測得潛伏期約 30 min（pAh1-C）和20 min（pAh6-C），裂解數量為60 PFU/細胞（pAh1-C）和10 PFU/細胞（pAh6-C）[11]。本研究分離得到的噬菌體NTHP01對多種病原菌具有良好的裂解作用，通過雙層平板法和滴注法發現該噬菌體能夠有效抑制水產養殖中的大多數致病菌，如副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌等，并形成明顯的噬菌圈。噬菌體NTHP01的寬譜性顯示，它在水產養殖中具有較為廣泛的應用前景，為水產健康生態養殖、保障水產品安全及抗生素減量使用提供了新的技術手段。

綜上所述，噬菌體NTHP01噬菌譜寬，對水產養殖中的大多數致病菌具有較好的抑制作用，為噬菌體作為替代抗生素在水產病防控中的應用提供了一定的理論依據。通過分析掌握噬菌體的理化特征，為后續規模化制備提供了理論依據，為該噬菌體在水產養殖中的推廣應用奠定了基礎。

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