添加防腐劑的五氯柳胺混懸液抑菌效力的檢測與評價

姜興粲　李冰　孫繼超　王瑋瑋　張吉麗　 張繼瑜

摘要：為了比較添加防腐劑的五氯柳胺混懸液與未添加此類防腐劑的五氯柳胺混懸液的抑菌效力，探討其防腐劑添加的合理性及必要性，選取未添加防腐劑和原藥、未添加防腐劑、添加防腐劑的制劑，采用《中華人民共和國藥典》2015版四部1121抑菌效力檢查法，以銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉5種菌株對其進行抑菌效力測定。結果表明：添加防腐劑的五氯柳胺混懸液均達到《中華人民共和國藥典》2015版抑菌效力標準;不添加防腐劑的未能達到抑菌效力標準。可見五氯柳胺混懸液中防腐劑的添加是合理的，不含防腐劑的五氯柳胺混懸液可能存在潛在的風險。

關鍵詞：五氯柳胺;混懸液;防腐劑;抑菌劑效力;評價

中圖分類號： S853.74? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0143-03

在國外，五氯柳胺是水楊苯胺類抗寄生蟲類藥物，對吸蟲病具有優良的療效，主要用于治療牛羊肝片吸蟲病，同時對絳蟲和線蟲均具有良好的治療效果。但在國內，五氯柳胺尚無成品制劑上市。本試驗對添加防腐劑（對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯）的五氯柳胺混懸液的抑菌效力進行了探究。口服制劑在使用過程中容易存在微生物污染問題，《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）允許這類產品添加防腐劑，但是過量的防腐劑存在危害，所以對防腐劑的應用進行評價[1-3]。本試驗針對未添加防腐劑的五氯柳胺（主藥）和添加防腐劑的五氯柳胺混懸劑的抑菌效力進行考察，探究其防腐劑添加的合理性。

1 試驗樣品、儀器及試驗設計

1.1 供試品

五氯柳胺混懸液（中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所自制），考察其抑菌效力情況。

1.2 儀器

隔水式恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺、LDZM-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）、電熱恒溫鼓風干燥箱、恒溫振蕩器、優普超純水制造系統、THOMAS細胞密度計、比色杯（光徑為10 mm）、KQ3200DE數控超聲波清洗器、BSA423S-CW天平（sartorius）、燒杯、三角瓶等。

1.3 培養基及試劑

胰酪大豆胨液體培養基（TSB）（產品批號：1073051）、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）（產品批號：1073051）、胰酪胨大豆瓊脂培養基（TSA）（產品批號：1073191）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）（產品批號：1072401）均來自廣東環凱微生物科技有限公司;培養基適用性檢查結果符合中華人民共和國藥典要求;對羥基苯甲酸甲酯（批號：20180118）和對羥基苯甲酸丙酯（批號：20130830）購自國藥集團化學試劑有限公司，氯化鈉（批號：L218041910）購自四川科倫藥業股份有限公司。

1.4 菌種

大腸埃希菌（E. enteritidis）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]菌種均來自中國食品藥品檢定研究院[1-5]。

1.5 試驗設計

參照《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部附錄通則[2]1105中“微生物學計數法”對五氯柳胺混懸液計數方法進行方法適用性試驗[1]。根據試驗結果，按照抑菌劑效力檢查法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部1121抑菌效力檢查法）對樣品進行抑菌劑效力測定[4-11]。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

參照“《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部1121抑菌效力檢查法”的方法進行菌液制備[1]。采用適宜方法制成含菌量約為107～108 CFU/mL的菌懸液，備用[9-19]。

2.2 計數方法的適用性

2.2.1 平皿法 取供試液，加入小于供試液體積1%的菌懸液，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 CFU，混勻后取 1 mL 置直徑90 mm的無菌平皿中，用于細菌培養的平皿注入20 mL溫度不超過45 ℃的胰酪胨大豆瓊脂培養基，用于真菌培養的平皿注入20 mL溫度不超過45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，按規定條件培養，計數[1，20-22]。

2.2.2 計數方法 回收率計算公式為：回收率=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液組平均菌落數，5種試驗菌回收率均高于90%，結果（表1）表明該方法可用于該供試品試驗。

2.3 抑菌效力測定

取供試品轉移至帶塞塑料管中，每管50 mL，混勻，作為供試品溶液備用。同法制備5份。分別取菌液制備中的菌懸液（或孢子懸液）0.5 mL接種于上述供試品溶液中，每個容器接種1種試驗菌，混合，使供試品溶液中的試驗菌均勻分布[1]。在試驗期間，接種的供試品溶液置25 ℃培養箱中避光貯存。根據《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1121“抑菌效力檢查法”抑菌劑效力，按口服制劑規定的間隔時間，分別從每個接種過的供試品容器中取供試品1 mL，用09%氯化鈉進行10倍倍比稀釋，對各稀釋級按相應的微生物計數方法進行操作。根據各間隔時間的菌數lg值相對于初始菌數lg值減少程度進行評價[23-27]。

2.4 抑菌效力評價標準

五氯柳胺混懸液抑菌效力評價標準按照《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部通則1121“抑菌效力檢查法”中口服制劑的抑菌效力判斷標準[1]。該判斷標準分為A、B 2個標準，“A”是指應達到的抑菌效力標準，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應的風險，則至少應達到“B”的抑菌效力標準，滿足《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部通則中抑菌效力檢查法對口服制劑和直腸給藥制劑抑菌效力的規定，與接菌量比較，14 d細菌數下降均不小于3lg值，真菌數下降均不小于1lg值，28 d細菌和真菌數對前一個測定時間增加的數量不超過0.5 lg值[1，25-30]。

2.5 未添加防腐劑和原藥、添加防腐劑的制劑及主藥（未添加防腐劑）的抑菌效力結果

未添加防腐劑和原藥的五氯柳胺混懸液抑菌效力結果見表2。添加防腐劑五氯柳胺混懸液制劑抑菌效力結果見表3。主藥（未添加防腐劑五氯柳胺混懸液）抑菌效力結果見表4。

3 討論

3.1 處方分析

主藥五氯柳胺對革蘭氏陽性菌特別是金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用，對部分革蘭氏陰性菌也有一定的抑制作用，對霉菌的抑菌作用較弱。防腐劑（對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯）對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及霉菌都有一定的抑制作用。五氯柳胺與防腐劑配合使用后，具有較為理想的廣譜抗菌作用[12]。

3.2 抑菌效力結果分析

表2表明未添加防腐劑和原藥的五氯柳胺混懸液在進行抑菌效力測試中，細菌中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌14 d菌數下降大于2.0lg，但是均達不到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的要求;真菌中黑曲霉 14 d 菌數下降大于0.5lg且小于1.0lg，可知其不符合《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標準。表3表明添加防腐劑的五氯柳胺混懸液制劑在進行抑菌效力測試中，細菌和真菌14d菌數下降大于3.0lg，28 d未恢復生長，從測試結果得出其符合《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標準。表4數據顯示，主藥進行抑菌效力測試中，細菌：14d菌數下降只有金黃色葡萄球菌大于30lg，且28 d時未恢復生長;大腸埃希菌和銅綠假單胞菌 14 d 菌數下降大于20lg，小于3.0lg， 雖然 28 d 時未恢復生長，但未能達到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的14 d抑菌效力標準。真菌：白色念珠菌和黑曲霉14 d下降均小于1.0lg，未能達到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標準[1]。

3.3 添加防腐劑的必要性

防腐劑可以用于抑制微生物的生長繁殖，防止微生物污染而影響產品質量。若藥品制劑不具有足夠的抑菌作用，為了防止藥品制劑在使用中發生微生物污染，產生危害，在藥品制劑中應加入合適的防腐劑，特別是口服液這樣的藥品制劑[12，31]。《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）中抑菌效力檢查法項下規定，用于存活菌數測定的方法，其方法適應性驗證試驗菌的回收率不得低于70%。本次測試中不添加防腐劑（對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯）的五氯柳胺混懸液未能達到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標準。抑菌效力檢查結果證明，在五氯柳胺混懸液處方中加入防腐劑可達到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）抑菌效力要求[1]。

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