套袋微環(huán)境對(duì)香蕉中苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺內(nèi)吸性和降解速率的影響及機(jī)制

趙小云　謝德芳　田海

摘要：通過(guò)對(duì)不套袋施藥、套袋后施藥和套袋前施藥3種施藥方式下的香蕉中苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺殘留量進(jìn)行分析，并對(duì)袋內(nèi)外光溫度、濕度和光照等環(huán)境因子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，探討套內(nèi)溫度、濕度和光照等環(huán)境因子的變化對(duì)苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的內(nèi)吸作用和降解速率的影響，并就其機(jī)制進(jìn)行分析。結(jié)果表明，套袋后，袋內(nèi)可形成高溫、高濕和弱光的特殊環(huán)境條件;與不套袋相比，套袋后苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的內(nèi)吸作用受到抑制，導(dǎo)致其在香蕉中的內(nèi)吸量降低;袋內(nèi)高溫、高濕和弱光的特殊環(huán)境可降低植物的蒸騰作用，使苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中傳導(dǎo)和吸收的量受阻，從而降低了2種農(nóng)藥在香蕉中的內(nèi)吸量;與不套袋相比，套袋后苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率減慢;袋內(nèi)高溫、高濕和弱光的特殊環(huán)境可降低植物的蒸騰作用和有關(guān)酶的活性，可使苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的代謝降解受到抑制，使其降解速率減慢，并且在微環(huán)境條件下，對(duì)不同種類(lèi)的農(nóng)藥抑制作用不同，對(duì)苯醚甲環(huán)唑的降解影響較大，對(duì)噻呋酰胺的抑制影響較小。

關(guān)鍵詞：套袋微環(huán)境;香蕉;苯醚甲環(huán)唑;噻呋酰胺;內(nèi)吸作用;降解速率;影響機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào)： S668.101;S481+.8? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0154-05

苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺都是新型、高效、廣譜、低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)、環(huán)境友好的殺菌劑[1-3]，對(duì)真菌引起的葉斑病、炭疽病和立枯病等疾病有著較好的治療和防護(hù)作用[4-6]，是防治香蕉葉斑病的主要農(nóng)藥品種。果實(shí)套袋已成為我國(guó)果樹(shù)生產(chǎn)的一項(xiàng)重要栽培技術(shù)，其應(yīng)用幾乎覆蓋所有果樹(shù)品種[7]，香蕉套袋技術(shù)目前已經(jīng)被普遍運(yùn)用。目前，對(duì)套袋后的袋內(nèi)光照、溫度和濕度等特殊微環(huán)境的變化已有不少研究，如李云昌等研究了套袋對(duì)荔枝果穗微環(huán)境光照、溫度的影響[8];王磊等研究了套袋對(duì)番茄果實(shí)微環(huán)境的影響[9]。而套袋微環(huán)境對(duì)果蔬的影響多集中于對(duì)果蔬品質(zhì)的影響，其中包括對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)[10]、色素[11]、礦物質(zhì)[12]等的影響，而套袋微環(huán)境的變化對(duì)果蔬中農(nóng)藥內(nèi)吸作用和降解速率的影響和機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)不套袋施藥、套袋后施藥和套袋前施藥3種施藥方式下香蕉中苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)對(duì)袋內(nèi)外溫度、濕度和光照等環(huán)境因子的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，旨在探討袋內(nèi)微環(huán)境對(duì)香蕉中苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺內(nèi)吸作用和降解速率的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)愛(ài)博才思公司）;多管漩渦混合器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）;電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];落地式高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）;有機(jī)相針式濾器（尼龍，13 mm，0.22 μm）（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）;一次性使用無(wú)菌注射器（江西宏達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）;氮吹儀（杭州德克爾儀器設(shè)備公司）;色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1×50 mm，美國(guó)沃特世公司）。

甲醇、乙腈[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];氯化鈉（廣州化學(xué)試劑廠）;十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）（安捷倫科技有限公司）;噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)品;苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)時(shí)間為2017年2月22日至5月12日。試驗(yàn)地點(diǎn)為海南省海口市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心實(shí)驗(yàn)基地。試驗(yàn)藥劑為27.8%噻呋酰胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑（有效成分1及其含量：噻呋酰胺13.9%;有效成分2及其含量：苯醚甲環(huán)唑13.9%）。試驗(yàn)作物為香蕉。

試驗(yàn)方法：27.8%噻呋酰胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑在香蕉上防治葉斑病的最高推薦使用劑量為417 mg a.i./kg（試劑與水的體積比為1 ∶ 667），施藥方式為全株噴霧，施藥次數(shù)為1次。試驗(yàn)小區(qū)有6棵香蕉，試驗(yàn)重復(fù)2次。

施藥時(shí)期及施藥方法：果實(shí)半大時(shí);果實(shí)不套袋、套袋前、套袋后整株噴。另設(shè)不施藥處理，采對(duì)照樣。

樣品的采集與制備：采樣距施藥時(shí)間為0 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間要求，以隨機(jī)的方法用小刀在試驗(yàn)香蕉樹(shù)不同方向及上、中、下不同部位采集7～8條（不少于2 kg）生長(zhǎng)正常、無(wú)病害、成功施藥的香蕉個(gè)體，裝入塑料袋中包扎妥當(dāng)，并貼上標(biāo)簽。將采集的樣品切碎，勻漿裝袋，貼上標(biāo)簽后于-20 ℃冰柜中冷凍保存，待測(cè)。

使用濕度計(jì)、溫度計(jì)和光照度計(jì)對(duì)田間濕度、溫度和光照數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。

1.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g香蕉樣品于50 mL離心管中，加入 20 mL 乙腈，勻漿2 min，渦旋2 min提取，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心5 min;取全部上清液于已加入10 g氯化鈉的離心管中，渦旋 1 min，以8 000 r/min離心5 min;取上清液10 mL于含PSA和無(wú)水硫酸鎂的離心管中，渦旋1 min后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，待進(jìn)樣。

1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱(chēng)取苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺（99.8%）標(biāo)準(zhǔn)品 0.010 0 g（精確至0.000 1 g），用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中保存。準(zhǔn)確移取適量?jī)?chǔ)備液，分別用甲醇稀釋成10.00、5.00、1.00、0.10、0.05 μg/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照“1.3”節(jié)中所述方法，對(duì)空白香蕉樣品進(jìn)行處理，取適量濃度一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入2 mL體積的容量瓶中，氮?dú)獯蹈桑犹幚磉^(guò)的空白香蕉基質(zhì)，配制成0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，待進(jìn)樣。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×50 mm，1.7 μm），柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為0.25 μL，梯度洗脫條件詳見(jiàn)表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI）;掃描模式為正、負(fù)離子掃描;離子源氣體GS1：0.344 75 MPa，離子源氣體GS2：0.344 75 MPa;離子噴霧電壓為5 500 V;氣簾氣：0.137 90 MPa;離子源溫度為600 ℃。檢測(cè)方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化條件下苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

優(yōu)化條件下苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜分別見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

將0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL系列濃度的苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和香蕉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在“1.5”中的條件下進(jìn)樣，以其峰面積（y）對(duì)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。苯醚甲環(huán)唑的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.17×104x+118×106（r=0.999 4）;噻呋酰胺的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=604×103x+8.3×105（r=0.999 3）。

2.3 方法的準(zhǔn)確度、精密度

在空白香蕉中分別進(jìn)行0.10、1.00、10.00 mg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。在0.10、1.00、10.00 mg/kg 3個(gè)添加水平下，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的平均回收率分別為94.9%～107.5%和93.6%～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.2%～9.0%和3.2%～9.3%，方法顯示了良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足試劑樣品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

檢出限和定量限分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算。分別以0.01、0.02 mg/kg添加水平的色譜圖進(jìn)行衡量，得到苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的檢出限和定量限分別為 1.0、3.3 μg/kg 和0.5、3.3 μg/kg。

2.5 苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的內(nèi)吸作用

苯醚甲環(huán)唑在香蕉中的消解動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖3，3種施藥方式下，苯醚甲環(huán)唑在香蕉中的殘留量都先升高后降低，并在3 d后其殘留量達(dá)到最大值，表明苯醚甲環(huán)唑有較強(qiáng)的內(nèi)吸性，可通過(guò)莖、葉等部位傳導(dǎo)到果實(shí)部位，使其殘留量升高;不套袋施藥、套袋前施藥和套袋后施藥3種施藥方式下，苯醚甲環(huán)唑在香蕉中因內(nèi)吸作用而增加的農(nóng)藥量依次為0.54、0.26、0.08 mg/kg，由此可得不套袋施藥苯醚甲環(huán)唑在香蕉中的內(nèi)吸量高于套袋前施藥和套袋后施藥。

噻呋酰胺在香蕉中的消解動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖4，不套袋施藥、套袋前施藥和套袋后施藥3種方式下，噻呋酰胺的殘留量都表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，表明噻呋酰胺在香蕉中具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性。此外，不套袋施藥、套袋前施藥和套袋后施藥3種處理下，噻呋酰胺在香蕉中因內(nèi)吸作用而增加的農(nóng)藥量依次為0.33、0.20、0.11 mg/kg，同樣可得不套袋處理下，噻呋酰胺的內(nèi)吸量較套袋處理下的內(nèi)吸量高。

試驗(yàn)表明，不套袋處理下，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的內(nèi)吸量較套袋處理高，袋內(nèi)的微環(huán)境條件可能會(huì)抑制2種農(nóng)藥的內(nèi)吸作用，使其內(nèi)吸量低于不套袋處理。

2.6 苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中消解速率

苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的消解曲線如圖5和圖6所示。

不套袋施藥，苯醚甲環(huán)唑在香蕉中消解的一級(jí)熱力學(xué)方程為C=2.024 9e-0.063t（R2=0.953 4），半衰期T1/2=11.0 d;套袋前施藥，苯醚甲環(huán)唑在香蕉中消解的一級(jí)熱力學(xué)方程為C=1.152 4e-0.030t（R2=0.853 6），半衰期T1/2=23.1 d。不套袋方式下苯醚甲環(huán)唑在香蕉中的消解半衰期小于套袋方式下苯醚甲環(huán)唑在香蕉中的半衰期。表明套袋后苯醚甲環(huán)唑的消解速率減慢。

不套袋處理下，噻呋酰胺在香蕉中的消解方程為C=1.459 3e-0.047t，R2=0.935 6，半衰期T1/2=14.7 d;套袋前施藥，噻呋酰胺在香蕉中的消解方程為C=2.050 6e-0.043t，R2=0.879 4，半衰期T1/2=16.1 d。不套袋處理下，噻呋酰胺在香蕉中的半衰期小于套袋處理，表明套袋處理可降低噻呋酰胺在香蕉中的消解速率。

試驗(yàn)表明，套袋后苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率都減慢。

不套袋施藥，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中消解半衰期分別為11.0、23.1 d;套袋前施藥，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中消解半衰期分別為14.7、16.1 d，套袋處理與不套袋處理，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的半衰期分別延長(zhǎng)12.1 d和 1.4 d。說(shuō)明套袋處理對(duì)苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的降解都有一定的抑制作用，但抑制作用的強(qiáng)弱不同，對(duì)苯醚甲環(huán)唑降解的抑制作用較大，對(duì)噻呋酰胺降解的抑制作用較小。說(shuō)明袋內(nèi)的微環(huán)境對(duì)不同種農(nóng)藥的降解速率影響不同。

2.7 袋內(nèi)外溫度、濕度和光照變化數(shù)據(jù)

2.7.1 袋內(nèi)外溫度變化趨勢(shì) 袋內(nèi)、外溫度變化曲線分別見(jiàn)圖7、圖8。

袋外溫度最大值為37.6 ℃，最小值為15.4 ℃，平均值為25.3 ℃，極值為22.2 ℃;袋內(nèi)溫度最大值為38.7 ℃，最小值為17.6 ℃，平均值為26.4 ℃，極值為21.1 ℃。袋內(nèi)溫度比袋外平均溫度高1.1 ℃，一般看來(lái)，溫度變化趨勢(shì)為18：00至次日07：00溫度逐漸降低，07：00至18：00溫度逐漸升高，在14：00至16：00溫度達(dá)到最高，變化趨勢(shì)呈峰型，白天溫度高，夜間溫度低。這與陳俊偉等的試驗(yàn)研究結(jié)果[13-14]一致。

2.7.2 袋內(nèi)外濕度變化趨勢(shì) 袋內(nèi)外濕度變化曲線見(jiàn)圖9、圖10。袋內(nèi)相對(duì)濕度（RH）最大值為100%，最小值為569%，平均值為93.0%;袋外相對(duì)濕度最大值為100%，最小值為39.3%，平均值為83.5%。袋內(nèi)平均相對(duì)濕度比袋外高9.5%，一般看來(lái)，濕度變化趨勢(shì)為20：00至次日08：00濕度逐漸升高，24：00至次日 04：00 濕度達(dá)到最大值，接近100%，在08：00至20：00濕度逐漸下降，這與溫度的變化趨勢(shì)正好相反。隨溫度的升高，濕度降低。這與張斌斌等的試驗(yàn)結(jié)果[15-16]一致。此外發(fā)現(xiàn)果實(shí)套袋以后，由于果袋透氣性差，果實(shí)袋內(nèi)環(huán)境與果實(shí)袋外環(huán)境熱量交換受阻，導(dǎo)致袋內(nèi)溫度高，濕度大，形成了獨(dú)特的微域環(huán)境[17]。

2.7.3 袋內(nèi)外光照變化趨勢(shì) 使用照度計(jì)對(duì)田間香蕉袋內(nèi)外的光照強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，袋內(nèi)的光照遠(yuǎn)低于袋外光照，形成弱光環(huán)境。大多數(shù)套袋為果實(shí)提供了一個(gè)較高溫、高濕、弱光的微域環(huán)境[18]。

2.7.4 套袋微環(huán)境對(duì)苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中內(nèi)吸性和降解影響的機(jī)制 溫度、濕度和光照等環(huán)境因素與農(nóng)藥殘留、農(nóng)藥吸附和農(nóng)藥降解關(guān)系密切[19]，藥劑在植物體內(nèi)的傳導(dǎo)速度和輸導(dǎo)量受其蒸騰速度和氣候因子等影響[20-21]。果實(shí)套袋改變了果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的光照、 溫度、濕度、氣體等微環(huán)境條件，從而影響植物蒸騰作用，對(duì)果實(shí)中農(nóng)藥代謝降解等生理過(guò)程產(chǎn)生了復(fù)雜的影響[22-23]。光照對(duì)蒸騰作用影響最大，因此對(duì)農(nóng)藥的吸收影響最大，弱光不利于農(nóng)藥的吸收，溫度高不利于農(nóng)藥的吸收，套袋果實(shí)處在高濕環(huán)境下蒸騰作用較低。袋內(nèi)形成的高溫環(huán)境和弱光環(huán)境降低了果實(shí)的蒸騰作用，還影響果實(shí)內(nèi)各種酶活性[24-25]，因此生長(zhǎng)在紙袋微域環(huán)境中的果實(shí)能降低農(nóng)藥在果實(shí)中的殘留量和降解速率[26]。

套袋后苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的內(nèi)吸量都降低，袋內(nèi)微環(huán)境可能會(huì)抑制2種農(nóng)藥的內(nèi)吸作用，使其內(nèi)吸量低于不套袋處理。這是由于套袋后袋內(nèi)的高溫、高濕和弱光環(huán)境降低了香蕉果實(shí)的蒸騰作用，2種農(nóng)藥在果實(shí)中的吸收和傳導(dǎo)量降低，從而使其內(nèi)吸量低于不套袋處理。

套袋后，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率都降低。這是由于套袋后，袋內(nèi)形成的高溫、高濕和弱光環(huán)境降低了香蕉果實(shí)的蒸騰作用，從而降低了農(nóng)藥的代謝與降解，導(dǎo)致降解速率減慢。

3 結(jié)論

套袋后，袋內(nèi)形成了高溫、高濕和弱光的特殊環(huán)境條件。與不套袋相比，套袋后苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的內(nèi)吸作用受到抑制，導(dǎo)致其在香蕉中的內(nèi)吸量降低;袋內(nèi)高溫、高濕和弱光的特殊環(huán)境可降低植物的蒸騰作用，使苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的傳導(dǎo)和吸收受阻，從而降低了藥劑在香蕉中的最高殘留量。與不套袋相比，套袋后苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率減慢;袋內(nèi)高溫、高濕和弱光的特殊環(huán)境可降低植物的蒸騰作用和有關(guān)酶的活性，使苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的代謝降解受到抑制，因而藥劑的降解速率降低，并且，對(duì)不同的藥劑作用效果不同，對(duì)苯醚甲環(huán)唑的降解抑制較大，對(duì)噻呋酰胺的影響較小。

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