1-MCP對獼猴桃后熟品質的影響

曹森，馬超，黃亞欣，和岳，巴良杰，吉寧，何貴紅，王瑞*，顧紅艷

1(貴陽學院 食品與制藥工程學院,貴州 貴陽，550005)2(貴州省果品加工工程技術研究中心,貴州 貴陽，550005)3(修文縣農業(yè)局,貴州 修文，550200)4(貴州大學 電氣工程學院,貴州 貴陽，550005)

獼猴桃(Actinidiachinensis)，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬植物，具有多種營養(yǎng)成分和抗氧化功能，并且含有預防疾病方面功能的保健因子，因此越來越受到人們的重視[1-2]。獼猴桃果實屬于呼吸躍變型，采后的果實有明顯的后熟軟化現(xiàn)象[3]，采后腐爛損失直接限制獼猴桃的儲存壽命[4]。目前，獼猴桃有效的保鮮方式主要是低溫結合1-甲基環(huán)丙烯保鮮劑[5-6]。

1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)是一種乙烯受體抑制劑，可以有效抑制乙烯與受體的結合及信號傳導，推遲果實的軟化進程，延緩果實成熟與衰老。但有研究表明1-MCP濃度使用不當會影響獼猴桃后熟口感，果實出庫后難以后熟，果心和果皮硬化，口感差、果肉褐化、腐爛率高[7-8]，也就是目前市場上反饋的“僵尸果”現(xiàn)象。關于1-MCP在獼猴桃上的使用報道的較多，但關于不同濃度1-MCP在獼猴桃保鮮方面系統(tǒng)的報道較少，尤其針對不同濃度1-MCP探究果實的后熟口感及影響乙烯合成途徑的關鍵基因表達還為見過相關報道。因此，本研究以“貴長”獼猴桃為材料，研究不同濃度1-MCP對“貴長”獼猴桃貯藏期間和貨架期間的理化參數(shù)和酶活性，并且研究了1-MCP影響獼猴桃成熟過程中乙烯生物合成途徑的2個關鍵基因表達及合成，進而解釋高濃度的1-MCP對獼猴桃造成“負面影響”問題，從而尋找獼猴桃適宜后熟品質的1-MCP閾值，以期為達到更好地保持獼猴桃后熟品質提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“貴長”獼猴桃鮮果,于2017 年10月12日采摘于貴州省貴陽市鵬盛通農業(yè)有限公司基地；1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)，購自美國陶氏益農公司; PE保鮮膜(厚度為20 μm)，由國家農產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心生產(chǎn)。

TA.XT.Plus質構儀，英國SMS公司；精準控溫保鮮庫(±0.5℃、(90±5)%)，國家農產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心(天津)；熒光定量機(CFX96 Touch Deep well)，美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 處理方法

“貴長”獼猴桃采摘后立即運回貴州省果品加工工程技術研究中心果蔬貯藏與保鮮研究室。選擇大小基本一致、無病蟲害、無機械損傷的果實，分 7組，每組120 kg果實，使用大功率工業(yè)風扇對獼猴桃除去田間熱，愈傷24 h后分別置于7個低密度聚乙烯(厚度：0.08 mm，體積：1 m3)帳內，以不同質量濃度1-MCP (0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μL/L) 分別對6組樣品進行熏蒸處理24 h，溫度為[(25 ±1)℃]， 另一組對照處理(CK)只放相同質量的蒸餾水。熏蒸后經(jīng) 20 μm的PE保鮮膜分裝(10 kg/袋)，每組設 3個重復，分裝后的果實放置(0 ± 0.5)℃的環(huán)境中預冷24 h后扎袋貯藏，貯藏120 d后出庫進行貨架實驗，貨架果實擺放在溫度為(25 ±2)℃房間內，每3 d對不同處理進行相關指標測定，測定周期為12 d。

1.2.2 感官品質評價

根據(jù)感官評價小組成員對貨架末期(12 d)時的獼猴桃口感風味進行評價，采用分析型感官實驗，參照宋小青等的測定方法[9]，略有改動，具體評價標準見表1。

表1 感官品質評價標準Table 1 Sensory quality evaluation standard

1.2.3 硬度的測定

參照曹森等報道的方法對果實硬度進行測定[10]。采用英國TA XT Plus物性測定儀測定，利用P/2探頭對其進行穿刺測試，測試參數(shù):穿刺深度為10 mm，測前速度為2 mm/s，測試速度為 1mm/s，測后速度為2 mm/s。

1.2.4 多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的測定

參照LOHANI等的報道的方法進行測定[11]。

1.2.5 呼吸強度和乙烯生成速率的測定

呼吸強度和乙烯生成速率的測定均參照張鵬等報道的方法進行測定[12]。

1.2.6 ACS活性和ACO活性的測定

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, ACS)活性和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, ACO)活性的測定均按曹建康的方法測定[13]。

1.2.7 RNA的提取及ACS1和ACO1基因表達的測定

用生工生物工程(上海)股份有限公司Trizol Reagent(NO. B610409)的RNA提取試劑盒提取獼猴桃樣品的RNA，然后用One Step RT-qPCR Kit(NO. B639277)把RNA反轉錄成cDNA，參照MINAS等[14-15]建立的獼猴桃熒光定量PCR的反應體系和程序進行試驗。獼猴桃ACS1和ACO1基因序列以及熒光定量引物參照MINAS等[14]的研究報道，具體引物見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.8 ACC含量和MACC含量的測定

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)含量和丙二酰基-1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(malonyl-1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, MACC)含量參照MINAS等的方法進行測定[14]

1.2.9 VC含量和固酸比含量的測定

VC含量和固酸比含量的測定均參照韓飛等報道的方法進行測定[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin Pro 2017軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，采用SPSS 19.0軟件的Duncan氏新復極差法進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析及用主成分分析法來分析各樣品間的差異(P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著)。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度1-MCP處理對獼猴桃感官評價的影響

果實的感官品質決定其商品價值。由圖1可見，不同質量濃度的1-MCP處理均影響果實的外觀新鮮度、果肉顏色、硬度、多汁性、甜味、酸味、芳香味、過熟味及香味持久性，最終影響果實的綜合評價。1.25 μL/L和1.5 μL/L的處理組果實在多汁性、甜味、酸味、芳香味、過熟味及香味持久性方面均不如對照處理，并且兩處理組在硬度方面顯著高于其他處理組(P<0.05)，說明1-MCP質量濃度過高影響獼猴桃的后熟品質，造成爛而不軟的“僵尸果”。0.75 μL/L處理組的果實新鮮，果肉顏色好，硬度適中，豐富的多汁性、甜味和酸味適中，果實芳香味濃、無過熟味道，香味持久性好，并且綜合評價高，均好于其他處理，0.5 μL/L處理組次之，0.25 μL/L和1 μL/L的處理組好于對照處理，但均不如0.5 μL/L處理組和0.75 μL/L處理組。貨架末期(12 d)時，通過對不同處理的果實感官品質綜合評價分析可知， CK組、0.25 μL/L組、0.5 μL/L組、0.75 μL/L組、1 μL/L組、1.25 μL/L組和1.5 μL/L組的綜合評價分別為3.48、5.48、8.44、9.12、4.85、2.25、1.86，其中0.75 μL/L組的綜合評價最高，其次為0.5 μL/L組。因此，適宜的1-MCP質量濃度能夠更好地保持果實的后熟感官品質，1-MCP質量濃度過高會導致獼猴桃感官品質出現(xiàn)負面效應。

圖1 1-MCP處理對獼猴桃感官品質的影響Fig.1 Effects of 1-MCP treatment on the sensory quality of kiwifruit

2.2 不同質量濃度1-MCP處理對獼猴桃硬度和PG活性的影響

圖2-A表明，不同處理的果實硬度呈現(xiàn)下降趨勢，在冷藏結束時，1.25 μL/L和1.5 μL/L的處理組硬度均顯著高于其他處理(P<0.05)，但與其他處理沒有顯著差異(P>0.05)。CK、0.25 μL/L和1 μL/L的處理硬度在貨架期6 d時分別降至1.16、1.48和1.37 kg/cm2，而此時0.5 μL/L和0.75 μL/L的處理組硬度分別為4.57、4.33 kg/cm2。STEC等[16]報道了當獼猴桃硬度為0.5 ～1.5 kg/cm2，果實食用口感良好。說明貨架期6 d時，CK、0.25 μL/L和1 μL/L的處理果實均處于可食階段。貨架末期(12 d)時，1.25 μL/L和1.5 μL/L的處理組硬度均顯著高于其他處理(P<0.05)，這與圖1貨架末期感官品質結果相一致。0.5 μL/L和0.75 μL/L的硬度分別為0.98、1.26 kg/cm2， 說明此時依然處于可食階段。而CK、0.25 μL/L和1 μL/L的處理硬度分別為0.21、0.35、0.45 kg/cm2，說明3個處理組在貨架末期由于過軟已處于不可食階段。圖2-B表明，PG活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在冷藏期間，不同處理沒有顯著差異(P<0.05)。 貨架期開始，CK和0.25 μL/L的處理組PG活性開始快速上升，至貨架期6 d時，兩處理PG活性達到最大值。

圖2 1-MCP處理對獼猴桃硬度(A)和多聚半乳糖醛酸酶活性(B)的影響Fig.2 Effects of 1-MCP treatment on the firmness and the polygalacturonase of kiwifruit

貨架期12 d時，不同處理組的PG活性大小關系為CK組>0.25 μL/L組>1 μL/L組>0.5 μL/L組>0.75 μL/L組>1.25 μL/L組>1.5 μL/L組，并且在整個貨架期，1.25 μL/L和1.5 μL/L的處理組PG活性均處于較低水平。PG活性影響果實的軟化[17]，這與圖2-A研究的結果一致。因此，0.75 μL/L組能夠更好地保持果實的硬度，維持適宜的PG活性，0.5 μL/L 組次之。

2.3 不同質量濃度1-MCP處理對獼猴桃呼吸強度和乙烯生成速率的影響

呼吸速率是反映儲存效果的重要指標。在一般情況下，呼吸強度越高，果實呼吸越旺盛，進而營養(yǎng)成分消耗[17-18]。由圖3-A可見，經(jīng)過120 d的冷藏，1-MCP處理組果實呼吸強度沒有顯著差異(P>0.05)，而CK組達到呼吸高峰，貨架期3 d時， 0.25 μL/L、1 μL/L、1.25 μL/L 和1.5 μL/L的處理組果實呼吸強度均達到呼吸高峰， 0.5 μL/L和0.75μL/L的處理在貨架期 6 d 時才達到呼吸高峰。

圖3 1-MCP處理對獼猴桃呼吸強度(A)和乙烯生成速率(B)的影響Fig.3 Effects of 1-MCP treatment on the respiration intensity and the ethylene production rate of kiwifruit

貨架末期(12 d) 時，不同處理組的呼吸強度大小關系為CK組>0.25 μL/L組>1 μL/L組>1.25 μL/L組>1.5 μL/L組>0.5 μL/L組>0.75 μL/L組，并且不同處理組均顯著低于對照組(P<0.05)。果實在冷藏120 d維持較低的乙烯生成速率(圖3-B)，并且相互之間沒有顯著差異(P>0.05)。貨架期3 d，CK、0.25 μL/L和1 μL/L的處理組乙烯生成速率均快速上升，在貨架末期時，不同處理組的呼吸強度大小關系為CK組>0.25 μL/L 組>1 μL/L組>0.5 μL/L組>0.75 μL/L組>1.25 μL/L組>1.5 μL/L組。說明適宜濃度的1-MCP均能夠更好地保持果實的呼吸強度，降低果實的乙烯生成速率，推遲果實呼吸峰的出現(xiàn)，但果實乙烯生成速率過低，有可能導致爛而不軟的“僵尸果”出現(xiàn)。

2.4 不同質量濃度1-MCP處理對獼猴桃乙烯生物合成的影響

圖4-A顯示隨著果實的軟化，ACS活性呈現(xiàn)上升趨勢，在冷藏120 d內，不同處理的ACS活性沒有顯著差異(P>0.05)。從貨架期開始對照處理的ACS活性快速上升，貨架期9 d時不同處理的ACS活性達到峰值，并且CK組顯著高于其他處理(P<0.05)，1.25 μL/L組和1.5 μL/L組處理的ACS活性均一直處于較低水平。圖4-B表明，從冷藏期間到貨架期間CK組果實的ACO活性均高于其他處理。不同處理組果實ACO活性。貨架期12 d時，不同處理的ACO活性大小關系為CK組>0.25 μL/L組>1 μL/L組>0.5 μL/L組>0.75 μL/L組>1.25 μL/L組>1.5 μL/L組。說明適宜濃度的1-MCP能在貨架期9 d均開始出現(xiàn)下降的趨勢，這有可能由于貨架后期獼猴桃腐爛率快速導致的(圖1)，這與MA等研究結果一致[18夠保持果實的ACS活性和ACO活性。

圖4-C和圖4-D表明在冷藏120d內，經(jīng)過不同質量濃度的1-MCP處理對獼猴桃ACS1和ACO1基因表達的積累沒有顯著差異(P>0.05)。由圖4-C可見，貨架期3 d開始不同處理的獼猴桃均顯示ACS1和ACO1表達的快速上調。貨架期9 d時，不同處理的果實ACS1相對表達量的大小關系為CK組>0.25 μL/L組>0.5 μL/L組>0.75 μL/L組>1 μL/L組>1.25 μL/L 組>1.5 μL/L組，說明隨著1-MCP濃度增加，抑制ACS1的表達越明顯。貨架期9 d的果實顯示ACS1表達快速下調，原因可能由于果實衰老導致(圖1)。貨架期12 d時，不同的處理ACS1相對表達量沒有顯著差異(P>0.05)。由圖4-D可見，從冷藏開始至貨架期3 d時，CK組顯著高于其他處理(P<0.05)，而1-MCP處理均處于較低水平。從貨架期3 d開始，不同1-MCP處理出現(xiàn)不同程度的ACO1表達上調。貨架期9 d時，不同處理的果實ACO1相對表達量均達到峰值，其大小關系同圖4-C貨架期9 dACS1的表達量一致。貨架期12 d時，CK組、0.25 μL/L 組、0.5 μL/L組、0.75 μL/L組、1 μL/L組、1.25 μL/L組和1.5 μL/L組ACO1相對表達量分別為13.74、100.46、65.50、50.72、23.24、33.23、19.12。由此說明不同濃度1-MCP影響ACS1和ACO1的相對表達量，1-MCP濃度過高導致ACS1和ACO1一直處于較低水平，進而影響乙烯的合成，影響果實的軟化，這與圖3-B研究結果一致。

圖4-E和圖4-F表明，在冷藏期間獼猴桃ACC和MACC含量均非常低，而從貨架期開始果實的ACC和MACC含量快速上升，經(jīng)過12 d的貨架期，不同處理的ACC和MACC含量的大小關系均為CK組>0.25 μL/L組>1 μL/L組>0.5 μL/L組>0.75 μL/L 組>1.25 μL/L組>1.5 μL/L組，并且CK組的果實ACC和MACC含量均顯著高于1-MCP 處理(P<0.05)，而1.25 μL/L組和1.5 μL/L組處理的ACC和MACC含量在整個貨架期間均處于較低水平，說明高濃度的1-MCP處理能夠極大地抑制ACC和MACC的積累。適宜濃度的1-MCP 能夠維持果實一定的ACC和MACC含量。

圖4 1-MCP處理對獼猴桃乙烯生物合成的影響Fig.4 Effects of 1-MCP treatment on the ethylene biosynthesis of kiwifruit

2.5 不同質量濃度1-MCP處理對獼猴桃VC含量和固酸比的影響

Vc是獼猴桃重要的營養(yǎng)成分，固酸比是果實完熟時口感和內在品質的重要指標。由圖5-A可見，冷藏120 d后，0.75 μL/L組果實的VC含量顯著高于其他處理(P<0.05)。從貨架期開始，CK組開始快速下降，貨架期12 d時，不同處理果實的VC含量大小關系為0.75 μL/L組>0.5 μL/L組>0.25 μL/L組>1 μL/L組>1.25 μL/L組>1.5 μL/L組>CK組。圖5-B表明，固酸比呈現(xiàn)上升的趨勢，果實的固酸比在前期上升可能由于后熟作用導致可溶固形物含量上升較快，從而使固酸比上升，而果實固酸比后期上升的原因可能由于可滴定酸含量下降較快的原因導致[9]。冷藏結束時，不同處理的固酸比沒有顯著差異(P>0.05)。貨架期12 d時，CK組、0.25 μL/L組、0.5 μL/L組、0.75 μL/L組、1 μL/L組、1.25 μL/L組和1.5 μL/L 組處理的果實固酸比分別為13.67、13.21、10.87、10.45、12.98、12.85、12.03。

圖5 1-MCP處理對獼猴桃VC含量(A)和固酸比(B)的影響Fig.5 Effects of 1-MCP treatment on the VC content and the ratio of sugar to acid of kiwifruit

由此說明，0.75 μL/L的處理能夠更好地維持果實VC的含量和口感，其次為0.5 μL/L的處理，這與圖1研究結果一致。

3 討論

在植物細胞中，乙烯是由S-腺苷蛋氨酸(SAM)合成的，由ACC合成酶(ACS)轉化為1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)。ACC隨后被ACC氧化酶(ACC)氧化(ACO)，產(chǎn)生乙烯、CO2和氰化物[19]，因此乙烯的產(chǎn)生率是由其直接前體ACC水平控制的[20]。通常，植物乙烯的生產(chǎn)維持在較低的基礎水平，但在某些發(fā)展階段或壓力刺激下會迅速而劇烈地誘導。雖然ACS通常被認為是乙烯生物合成的限速步驟，但有越來越多的證據(jù)表明，在不同植物的特定發(fā)育和脅迫條件下，ACO也作為控制點[21-22]。

ACS和ACC氧化酶(ACO)是乙烯生物合成途徑中涉及的兩個關鍵酶，都是各種植物器官的多基因家族編碼[23]。它們已被證明，乙烯的生物合成受到正面和負面的反饋調節(jié)[24]。為了進一步闡明獼猴桃成熟期間乙烯的生產(chǎn)的機制，我們評估了乙烯生物合成的關鍵酶的活性,即ACS和ACO。ILINA等研究表明乙烯-烯生物合成基因ACS1和ACO1分別對ACC合成酶和ACC氧化酶進行編碼[25]。盡管MACC并沒有被認為是ACC的重要存儲形式，但ACC丙二酰化反應仍然可以調節(jié)ACC水平[26]。

圖4-A和圖4-B顯示,隨著果實的軟化，ACS和ACO活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且1-MCP處理能夠抑制ACS和ACO活性的上升。但1 μL/L的1-MCP處理對2個關鍵酶活性的抑制反而不如低濃度0.5 μL/L和0.75 μL/L的處理，并且1.25 μL/L和1.5 μL/L一直處于較低水平。通過圖4-C和圖4-D表明,1.25 μL/L和1.5 μL/L的處理ACS1和ACO1的表達一直處于較低水平，進而影響乙烯的合成，降低了乙烯的生成速率(圖3)，這與圖4-E和圖4-F兩種處理(1.25 μL/L和1.5 μL/L)的ACC含量和MACC含量結果相一致。說明1.25 μL/L和1.5 μL/L的處理影響了果實的正常軟化，從而導致果實硬化(圖2)，口感差(圖5)等問題，也就是市場上反饋的“僵尸果”現(xiàn)象的原因。而1 μL/L的1-MCP在貨架后期能夠快速軟化，但1.25 μL/L和1.5 μL/L的1-MCP處理出現(xiàn)“僵尸果”現(xiàn)象，并且高濃度的(1 μL/L、 1.25 μL/L和1.5 μL/L)1-MCP貨架末期(12 d)果實的感官綜合評價較低(圖1)，原因可能是1-MCP濃度使用過高導致果實生理代謝紊亂，至于相關機理待于進一步研究。

4 結論

綜合比較，0.75 μL/L的處理能夠有效抑制果實ACS和ACO的酶活性及ACS1和ACO1的基因表達量，降低了ACC和MACC含量，維持果實的硬度、PG活性、VC含量和固酸比，保持果實更好地后熟品質，并且能夠使果實正常軟化，獼猴桃在貨架期12 d時的感官綜合評價高達9.12，0.5 μL/L的處理次之，而1.25 μL/L和1.5 μL/L的處理會出現(xiàn)果實硬化，口感差等“僵尸果”現(xiàn)象。因此，采后用0.5～0.75 μL/L 1-MCP 來處理獼猴桃對保持果實后熟品質的效果最好。