載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘治療股骨頸骨折的實驗研究

韓 寧 劉小翠 丁佳駿 劉圣珺 梁素萍 徐佳依 李增春

股骨頸骨折約占全部骨折總數的3.58%，且發生率日益增高，預計到2025年，全球股骨頸骨折數量將突破400萬例[1]。而股骨頸骨折臨床治療中的骨折不愈合和股骨頭缺血壞死，常導致患者病殘[2，3]。

目前，解剖復位股骨頸骨折并加壓固定骨折端已經形成共識[1]。早期骨折復位有助于恢復因骨折而扭曲的殘存股骨頭血供；牢固的內固定可避免骨折端再次移位造成血供破壞，為微血管的再生爬行提供良好環境[4,5]。但股骨頸骨折術后骨折不愈合發生率仍高達10%～30%，股骨頭缺血性壞死發生率約為15%～30%[6]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異性促血管內皮細胞增生及血管生成因子，對血管再生起著關鍵性作用[7，8]。骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)被認為是活性最強的唯一能單獨誘導成骨的因子，在骨的生長和損傷修復中發揮重要作用[8]。因此，筆者在內固定表面制備具有生物活性的BMP-2和VEGF涂層，誘導股骨頸骨折端和股骨頭內微血管和新骨形成，促進股骨頸骨折愈合避免股骨頭缺血壞死。

材料與方法

1.材料:新西蘭大白兔和昆明小鼠由同濟大學動物中心提供。高糖DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自以色列Beit Haemek有限公司，含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，人重組VEGF和人重組BMP-2標準品(美國Sigma公司)，培養瓶，24孔板(美國Corning公司)，紫外光分光光度儀(德國Eppendoff公司)。

2.PDLLA涂層的體外釋放檢測：聚消旋乳酸[poly(D，L-lactide)，PDLLA]以50mg/ml的濃度在室溫下溶解在有機溶劑乙酸乙酯中。100μg人重組VEGF和100μg人重組BMP-2標準品分別混勻于5ml PDLLA溶液中，充分浸泡無菌直徑3.5mm不同長度的鈦合金螺釘并在無菌層流條件下風干，此過程重復兩次。60Co輻照滅菌，無菌包裝備用。

配制VEGF和BMP-2對照品液，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為空白，紫外分光光度計在200～700nm范圍內分別確定VEGF和BMP-2的最大吸收波長。分別精密稱取VEGF和BMP-2對照品0.05g置100ml容量瓶中，以PBS定容，得到500μg/ml的溶液，然后分別稀釋，得到濃度分別為400、300、200、100、50、20、10μg/ml一系列標準溶液。分別用紫外分光光度計測定吸光度值，制備標準曲線。

將載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層鈦合金螺釘，浸入含20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值=7.4)的培養瓶中，于37℃恒溫振蕩(60r/min)水浴中，在預定的時間間隔點(1h、4h、8h、12h、1天、14天、28天、56天、84天)各取出100μl。用紫外分光光度計測定釋放液吸光度，對照標準曲線，計算VEGF和BMP-2的含量。每個樣品分別測定3次。

3.載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘的生物相容性：DMEM高糖培養液(含10%小牛血清)浸提VEGF和BMP-2的PDLLA涂層鈦合金螺釘(依照GB/T 16886和ISO 10993，材料質量與浸提介質體積比1g∶5ml)，浸提條件為37℃，72h，后以1200r/min離心5min，吸取上清液并經0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得實驗用樣品的浸提液備用。

4.體內全身急性毒性檢測、熱原反應和溶血實驗:依據GB/T 16886和ISO 10993醫療器械生物學評價規定，進行體內全身急性毒性檢測、熱原反應和溶血實驗。

(1)全身急性毒性檢測：選用健康昆明小鼠12只，6周齡，雌雄各半，體質量15～26g。將小鼠隨機分實驗組和對照組兩組，每組6只。實驗組小鼠腹腔注射樣品浸提液，每只小鼠注射劑量為50ml/kg；對照組腹腔注射無菌0.9%NaCl注射液50ml/kg，于注射后即刻及24、48、72h觀察和記錄實驗組和對照組動物一般狀態、毒性表現和死亡動物數。于注射前及注射后24、48、72h稱重并記錄兩組動物的體質量變化。

(2)熱原反應：選用健康成熟新西蘭大白兔12只，雌雄不限，體質量2.2～2.5kg，隨機分實驗組和對照組2組，每組6只。自實驗組新西蘭大白兔耳緣靜脈靜脈注射溫度為38℃的樣品浸提液(10ml/kg)，對照組耳緣靜脈注射溫度為38℃的含10%胎牛血清的DMEM培養液(10ml/kg)。注射后每隔1h測量體溫1次(測體溫時用精確肛溫計插入新西蘭大白兔肛門約6cm左右，測溫時間1.5min)，共3次，3次體溫中最高的1次減去注射前體溫即為體溫升高值。若體溫升高<1.4℃說明沒有致熱源物質存在。

(3)溶血實驗：選用新西蘭大白兔6只，雌雄不限，體質量2.2～2.5kg。抽取健康新西蘭大白兔靜脈血10ml，加入2%草酸鉀0.5ml，以0.9%生理鹽水10ml稀釋制備新鮮稀釋兔血。將實驗組(樣品浸提液)、陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(雙蒸水)各組試液10ml分別置于50ml三角瓶中，37℃水浴30min。加入新鮮稀釋兔血0.2ml搖勻，37℃水浴60min，以2000r/min離心5min取上清，紫外分光光度計于波長545nm測吸光度，實驗組和對照組吸光度均取3瓶平均值。溶血程度用溶血率(%)表示，為[(實驗樣品的吸光度值-陰性對照的吸光度值)/(陽性對照的吸光度值-陰性對照的吸光度值)]×100%。若實驗組溶血率>5%為陽性反應，表示有溶血現象。

5.體外細胞毒性實驗:(1)骨髓間充質干細胞培養及傳代擴增：密度梯度離心聯合差速貼壁法分離新西蘭大白兔的骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSC)。于新西蘭大白兔髂骨穿刺獲得骨髓重懸于DMEM高糖完全培養液(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，充分混勻后疊加到10ml percoll分離液(d=1.073g/ml)上層液面，900×g離心20min。PBS洗滌中間單核細胞層兩次，單細胞懸液以5×108/ml接種于25cm2培養瓶。置37℃、相對體積分數為5%CO2、飽和濕度的細胞孵箱培養48～72h后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每2～3天換液1次。生長至80%融合后以含0.02%EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取2×104個/毫升第3代BMSC細胞懸液備用。(2)細胞毒性實驗：96孔板內設實驗組、陽性對照組和陰性對照組，每組6復孔。每孔接種100μl第3代BMSC細胞懸液后，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，24h后棄去原培養液，PBS沖洗。實驗組加入200μl材料浸提液，陽性對照組加入200μl含0.64%苯酚和10%胎牛血清的DMEM培養液，陰性對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養液。置于37℃、5%CO2細胞培養箱中繼續培養。分別于培養24、48和72h后各取一塊培養板，各孔加入20μl的5%MTT，繼續培養4h后棄去孔內液體并加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10～15min，波長490nm處自動酶標檢測儀測吸光度。根據6級毒性評級標準計算各組相對增殖率(relative proliferation rate，RGR)，RGR=實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值。

6.新西蘭大白兔股骨頸骨折動物模型的建立和分組：健康成熟新西蘭大白兔12只，一級動物，雌雄各半，體質量2.5～3.9kg。將兔的右后肢作為實驗側，左后肢作為自身對照側。實驗側應用直徑3.5mm載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘固定；而對照側以直徑3.5mm螺釘固定。10%戊巴比妥鈉25mg/kg靜脈注射麻醉，開通靜脈補液通道。新西蘭大白兔俯臥位，常規備皮，消毒鋪巾。取雙側髖關節外側弧形切口，長約5cm，依次切開皮膚、皮下、深筋膜，內旋下肢切斷外旋肌群，保護坐骨神經，十字切開關節囊，顯露股骨頸，微型擺鋸于股骨頸基底部橫行截斷股骨頸，直視下復位，經股骨矩向股骨頭鉆孔、測深并置入直徑3.5mm載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘1枚固定。重新消毒鋪巾，相同技術制作左側股骨頸骨折，經股骨矩向股骨頭鉆孔、測深并置入3.5mm普通螺釘1枚固定作為對照組。術后允許自由活動，自由飲食。術后3日內每日予青霉素80萬單位肌內注射。術后兩周拆線。

7.檢測方法：(1)髖關節X線檢測：術后12周，取俯臥位攝髖關節X線片，所有攝片均采用同批底片，曝光條件相同(電壓55kV、電流55mA，曝光時間0.3s，焦距90cm)，觀察股骨頸骨折愈合過程及股骨頭密度變化。(2)micro-CT檢測:術后12周，麻醉狀態下處死新西蘭大白兔將雙側股骨近端完整取出，去除固定螺釘，各組標本行體外高分辨率micro-CT掃描。球管電壓 80kV，電流 80mA，曝光時間 3000ms，分辨率14mm，旋轉角度360°，旋轉角度增量0.5°。使用美國GE公司配套軟件對標本進行三維重建，在股骨頸和股骨頭內以直徑3mm，高6mm圓柱形區域作為感興趣(ROI)。分析骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數量(Tb.N)和骨體積分數(BV/TV)。

8.組織學分析:甲醛固定標本，流水沖洗過夜，10% EDTA溶液脫鈣2周。標本流水沖洗過夜，乙醇梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚約5μm，常規HE染色，光鏡下觀察術后12周骨折的愈合、股骨頭缺血反應及修復。用計算機輔助圖像分析系統以5個隨機200倍視野血管的均數表示該組織的微血管密度，檢測股骨頭內微血管變化。

結 果

1.PDLLA涂層的體外釋放檢測:取20μg/ml含VEGF和BMP-2的PDLLA溶液5ml，將直徑3.5mm皮質骨螺釘充分浸泡，并在無菌層流條件下風干螺釘，此過程重復兩次。VEGF和BMP-2在最初的8h內藥物是爆發性的釋放，隨后是比較持續和穩定的釋放，并且釋放可以持續12周。術后1h、4h、8h、12h、1天、14天、28天、56天和84天PDLLA涂層螺釘中VEGF緩釋量分別為1.16±0.10、2.28±0.44、15.99±1.41、19.09±0.98、19.51±0.80、19.87±0.75、21.20±0.63、34.84±1.22、47.62±1.46mg/L。術后1h、4h、8h、12h、1天、14天、28天、56天、84天 PDLLA涂層螺釘中BMP-2緩釋量分別為1.21±0.36、2.50±0.41、17.51±0.70、19.28±0.59、19.46±0.62、20.43±0.55、21.37±0.33、32.04±0.89、40.72±2.01mg/L。

2.載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘的生物相容性：(1)體內全身急性毒性檢測、熱原反應和溶血實驗：在72h觀察期內，對照組和實驗組小鼠一般情況良好，活動、食欲正常，呼吸平穩，無驚厥、腹瀉、癱瘓和動物死亡等毒性反應。實驗組(0.40±0.22)和對照組(0.40±0.26)體溫升高，兩組比較差異無統計學意義，且體溫升高值<1.4℃，該樣品符合熱原檢查的規定。浸提液溶血率0.96%，低于GB/T 16886和ISO 10993規定的5%，符合溶血實驗的規定。(2)體外細胞毒性實驗：實驗組(0.31±0.02、0.52±0.07、0.77±0.05)和陰性對照組(0.30±0.02、0.53±0.07、0.79±0.10)在24、48和72h的A值均明顯高于陽性對照組(0.19±0.02、0.21±0.03、0.28±0.06,P<0.01)，實驗組與陰性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組在24、48和72h的RGR(1.01、0.99和0.97)均顯著高于陽性對照組(0.62、0.40和0.36)。

3.新西蘭大白兔股骨頸骨折動物模型的建立和分組：制作12只新西蘭大白兔股骨頸骨折模型，右側作為實驗側置入3.5mm載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘1枚固定，左側置入3.5mm螺釘作為自身對照側。術后12周內所有實驗兔活動逐漸恢復正常。切口愈合良好，均于術后2周拆除切口縫線，無明顯炎性反應、切口裂開及關節脫位發生。

4.髖關節X線檢查：術后12周顯示雙側股骨頸骨折解剖復位，內固定堅強，采用涂層螺釘固定的右側股骨頸骨折已愈合，采用普通螺釘固定的左側股骨頸骨折處尚未完全愈合(圖1)。

圖1 術后12周髖關節X線檢查置入復合VEGF和BMP-2涂層螺釘的右側股骨頸骨折愈合，置入普通螺釘固定的左側股骨頸骨折尚未完全愈合(白色箭頭)

5.micro-CT：實驗側股骨近端BMD(323.42±43.31mg/mm3)、BV/TV(0.32±0.072)、Tb.Th(0.16±0.074mm)和Tb.N(2.15±0.43/mm)均較對照側明顯增加(P<0.01)，Tb.Sp(0.30±0.12mm)較對照側(0.78±0.31mm)降低(P<0.01)，詳見表1。

表1 股骨近端micro-CT檢測

與對照側比較，*P<0.01

6.組織學分析:術后12周，涂層螺釘和骨接觸界面多由血管化的新生骨組織構成，而非涂層側鈦合金和骨組織間為纖維組織層。實驗側釘道周邊微血管較對照側增多稠密。實驗側股骨近端每×400視野微血管數目(39.17±14.27)均較對照側(19.50±6.97)明顯增加(P<0.01)。雙側均未檢出股骨頭壞死的組織學改變。

圖2 HE染色觀察股骨頸骨折愈合(×400)A.實驗側釘道周邊骨小梁增粗增多，微血管密度增加；B.對照側釘道周圍纖維組織增生，骨化和微血管密度明顯下降

討 論

股骨頭頸部的滋養動脈主要來自于股骨遠端，股骨頸骨折幾乎等同于將股骨頭頸的血液供應完全切斷，易導致股骨頸骨折不愈合和股骨頭壞死。本研究應用載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘固定新西蘭大白兔股骨頸骨折，促進骨折端微血管形成，股骨頸和股骨頭內骨小梁增粗致密，加速股骨頸骨折愈合。而及早恢復股骨頭的血供，減少股骨頭缺血的時間，是降低股骨頭壞死發生率的關鍵[8～10]。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異性促血管內皮細胞增生及血管生成因子，對血管再生起著關鍵性調控作用[8,9]。本研究也證實涂層螺釘釋放的外源性VEGF顯著增加股骨頸和股骨頭內微血管數量。VEGF誘導的血管生成能增加骨折端血流量，促進軟骨內成骨及骨修復，加速骨折愈合；拮抗VEGF作用骨折端完全由纖維組織取代，抑制骨折愈合，X線提示骨折端出現肥大的不連續骨痂或無骨痂[10]。BMP-2被認為是活性最強的唯一能單獨誘導成骨的因子，促進未分化間充質細胞和成骨細胞前體細胞分化為成骨細胞，促進骨缺損修復和骨折愈合[8]。聯合應用BMP-2與VEGF既能誘導成骨，又能刺激血管再生，使新生的骨組織快速完成血管化[8]。本研究通過PDLLA將VEGF和BMP-2附著于內固定螺釘，顯著促進股骨頸和股骨頭內骨小梁增粗增多，使股骨頸骨折愈合加快，進一步證實了VEGF和BMP-2在骨折修復中的關鍵作用。

目前BMP-2或VEGF應用方式主要為附著于固態人工骨局部置入或液態載體局部注射于骨折端[11,12]。但目前股骨頸骨折的治療多采用閉合復位技術，術中不顯露骨折端，牽引床復位后經股骨外側3～5cm小切口置入直徑6.5mm或7.3mm半螺紋空心釘，經長約70～100mm釘道對股骨頸骨折端進行加壓固定。因此，往往難以將BMP-2或VEGF固態載體經狹長釘道置入骨折斷端，臨床操作困難。有研究者構建BMP-2或VEGF可注射性載體并在空心螺釘上靠近骨折端的部位打孔，便于BMP-2和VEGF有效作用于骨折斷端。但此種技術會導致螺釘力學性能下降，甚至疲勞折斷[13,14]。本研究將BMP-2和VEGF附著于內固定螺釘表面，在釘道全長均勻釋放發揮生物學作用，增加微血管數量、骨小梁數量和厚度，促進股骨頸骨折愈合。

自20世紀60年代以來，以PDLLA為代表的可降解性材料在醫學界就引起了關注。由于PDLLA為非晶態，無遲發性組織反應，生物相容性好，對骨修復干擾小，且降解吸收時間短，廣泛應用于生物降解醫用材料領域[15]。本研究中，PDLLA涂層螺釘的全身急性毒性檢測、熱原反應、溶血實驗和體外細胞毒性實驗也證實了其良好的生物相容性。由于PDLLA呈多孔態結構，有較高的孔隙率且孔隙間相互溝通，是一種具有良好生物相容性的可降解緩釋骨架，也是BMP-2和VEGF的常用控釋載體[16,17]。本研究應用PDLLA負載商品化的具有活性的VEGF和BMP-2，獲得至少12周的VEGF和BMP-2 持續釋放。李紹良等[18]應用PDLLA負載慶大霉素附著于鈦制克氏針表面進行涂層穩定性實驗，證明PDLLA涂層具有較強的機械穩定性，在置入髓腔的過程中絕大部分無脫失，并且可以保持PDLLA涂層在內固定表面均勻分布。因此，借助PDLLA負載BMP-2和VEGF固著于內固定螺釘表面治療股骨頸骨折，并顯著促進了股骨頸骨折愈合，有力證明了PDLLA涂層能夠提供足夠機械穩定將VEGF和BMP-2釋放至骨折端發揮生物學效應，為微血管和新生骨的再生提供良好環境。

另一方面，空心螺釘采用滑動加壓原理，螺桿提供滑動軸，將應力轉化為軸向壓應力，加壓骨折斷端，即使骨折修復過程中發生骨吸收塊，仍能保持骨折塊間緊密接觸[19]。這一特性在有力保護骨折的愈合環境的同時，可能導致股骨頸短縮，有研究發現空心螺釘固定后股骨頸短縮率達30%～42%，降低臨床療效[20,21]。本研究發現涂層螺釘和骨接觸界面多由血管化的新生骨組織構成，而非涂層側鈦合金和骨組織間為纖維組織層，表明復合VEGF和BMP涂層有助于增加空心螺釘把持力，同時BMP-2和VEGF促進骨修復的生物學效應可能有助于避免骨折斷端骨吸收所致的股骨頸短縮，改善臨床療效。雖然本研究中雙側均未發現股骨頭壞死，但涂層側股骨近端骨小梁增粗增多致密、骨密度升高、微血管數量增加，具有抑制股骨頭壞死的作用。

綜上所述，載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層生物相容性好，能夠牢固附著于鈦合金螺釘表面，促進股骨近端微血管增生和新生骨形成，加速股骨頸骨折愈合。該涂層制作簡便，生物學效應顯著，在股骨頸骨折治療領域具有廣闊的應用前景。