實時可視化LAMP快速檢測高危亞型HPV病毒方法的建立

俞煥騰,馬 骉,2,方結紅,林委,張明洲,2

(1．中國計量大學 生命科學學院,浙江 杭州 310018；2．浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室,浙江 杭州 310018)

子宮頸癌是一種常見婦科惡性腫瘤,對女性健康造成很大影響[1]。在我國,宮頸癌的發病率快速上升,是發病率增長速度最快的癌癥,居女性生殖系統腫瘤首位[2]。研究發現,高危亞型人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染是宮頸癌頻發的主要原因。因此,檢測宮頸細胞樣本中HPV載量和基因型,已成為宮頸癌預判的一種常規診斷途徑,為早期治療方案的制定提供依據。

如今,傳統培養法已經滿足不了快速檢測的要求,子宮頸癌的早期診斷需另辟新徑[3]。隨著分子生物學的發展,結合當下流行病學的研究現狀,針對HPV病毒的臨床診斷試劑種類較多。按照分子生物學的方法學原理,主要分為3類:熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)、基因芯片技術(gene chip technique)、第二代雜交捕獲技術[4](Hybrid capture 2)。這些技術以高特異性、高靈敏度等優勢,為病毒的快速篩查提供了支持。然而,相較于等溫擴增方法,這些檢測技術較大程度的依賴精密設備,不適用于現場快速診斷[5-6]。

作為一種高效恒溫的核酸擴增技術,環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)利用獨特的鏈置換循環,在60 ℃～65 ℃的恒溫環境下,短時間內實現靶序列的大量擴增[7]。擴增產物的常規驗證多由瓊脂糖凝膠電泳和濁度檢測等手段實現。為解決開蓋污染等問題,在反應液中添加鈣黃綠素等熒光染料,根據反應前后顏色的變化,實現可視化判讀反應結果[8]。……