結直腸癌錯配修復蛋白免疫組化結果誤判與對策

姜武，凌逸虹，吳曉丹，蔡木炎，張惠忠，林育珠，丁培榮*，潘志忠，萬德森

DNA錯配修復（MMR）系統是維持生物基因組穩定的重要途徑，其通過識別、水解受損DNA片段等一系列步驟實現MMR，從而保證了DNA復制過程的高保真性［1］。MMR基因胚系突變或者啟動子區甲基化會導致MMR蛋白功能缺失，進而導致腫瘤相關基因突變增多并累積，是結直腸癌重要的發病原因之一［2］。針對MMR蛋白，即MLH1、MSH2、MSH6和PMS2 4個蛋白的免疫組化檢測在結直腸癌臨床實踐中具有重要價值，MMR狀態可以預測5-氟尿嘧啶（5-FU）單藥輔助化療的療效［3］，并富集抗程序性細胞死亡蛋白（PD）-1免疫治療的優勢人群［4］，免疫組化檢測發現MMR蛋白缺失是結直腸癌患者預后良好的指標［5］，但同時也提示了Lynch綜合征的可能［6］，需要進一步進行遺傳篩查和基因檢測。盡管MMR蛋白免疫組化檢測已經在臨床上普遍開展，但在實踐中仍存在病理報告不夠規范的情況。為此，本文將對結直腸癌MMR蛋白免疫組化結果臨床判讀中出現的問題進行匯總分析，以為該項目后續的開展提供參考。

本研究價值：

作為一項逐漸普及的病理檢查，結直腸癌錯配修復（MMR）蛋白免疫組化結果判讀的規范性需要引起廣泛重視。不規范的判讀包括以百分數、半定量、+/-等表述形式；同時應警惕4個MMR蛋白染色結果均陰性的情況。醫務人員應明確MMR蛋白免疫組化染色結果是二分類的，且極少存在4個蛋白全部表達缺失，關注內對照染色質量，設置標準外對照病例，并對有疑問的染色結果及時復核，將有助于提升最終結果的準確性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年11月—2015年12月在中山大學腫瘤防治中心就診并進行MMR蛋白免疫組化檢測的結直腸腺癌患者，共3 357例，全部納入分析。

1.2 免疫組化檢測 免疫組化檢測采用Envision兩步法進行常規染色。采用的初始一抗單克隆抗體分別為MLH1克隆ES05抗體，MSH2克隆RED2抗體，MSH6克隆EP49抗體，PMS2克隆EP51抗體，以上均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品，檢測操作步驟按照說明書進行。

1.3 方法 回顧性分析MMR蛋白免疫組化檢測報告，并進行再判讀。免疫組化結果依據腫瘤及正常組織細胞核內染色情況進行判定：腫瘤細胞核無著色而內對照正常細胞核著色，判為MMR蛋白染色陰性，即MMR蛋白表達缺失；腫瘤細胞核與正常細胞核均著色，判為MMR蛋白染色陽性，即MMR蛋白正常表達。報告均由2位經驗豐富的高年資病理醫生獨立閱片得出，若出現判定結果不一致，則由第3位高年資病理醫生復核，綜合評定結果，篩選其中判讀不規范和存在爭議的結果，總結并重讀MMR蛋白免疫組化檢測結果。

2 結果

2.1 判讀MMR蛋白免疫組化結果表述不規范的病例情況共發現103例患者的免疫組化判讀結果表述存在爭議，認為其無法滿足臨床需求。不規范的判讀可總結為以下幾種類型：（1）以百分數形式描述的免疫組化結果，例如MLH1（80%+）等，共計25例患者；（2）以半定量形式描述免疫組化結果，即表述為弱+、局灶+、部分+、個別+等半定量形式，共計65例患者的75個染色指標；（3）免疫組化結果模糊表述為+/-，共計13例患者的14個染色指標。

2.2 MMR蛋白免疫組化結果表述不規范病例的重讀結果 對上述103例患者免疫組化結果再次閱片判讀，必要時進行重新染色。重讀結果如下：（1）25例以百分數形式描述的免疫組化結果，重讀結果均為染色陽性。（2）75個以半定量形式描述的免疫組化結果，重讀后69個指標為染色陽性，5個指標為染色陰性，1個指標仍無法判定（腫瘤組織缺失，無法重染復核）。（3）14個免疫組化結果模糊表述為+/-的指標，重讀后13個指標為染色陽性，1個指標為染色陰性（詳見表1）。

2.3 4個MMR蛋白免疫組化染色全陰的病例分析 共3例患者出現4個MMR蛋白免疫組化染色均為陰性，該檢測結果存在臨床爭議。經重新切片染色后，1例為4個MMR蛋白均染色陽性，即pMMR；1例為MSH6蛋白染色陰性，其余3個MMR蛋白染色陽性；1例為MLH1和PMS2蛋白成對染色陰性，其余2個MMR蛋白染色陽性（詳見表2）。

2.4 引起判讀結果爭議的原因 造成上述病例判讀結果爭議的原因除了部分病理醫生對判定標準不熟悉外，更重要的原因是染色片質量欠佳，造成判讀困難。包括如下2種典型情況：（1）內對照不表達或表達過弱，導致判讀為假陰性（見圖1A）或假陽性（見圖1B）。（2）非特異性染色，腫瘤細胞核染色定位不準，胞質彌漫染色，無法判斷腫瘤組織MMR蛋白表達情況（見圖1C）。

3 討論

鑒于MMR狀態對于腫瘤篩查、預后判斷及治療決策上的積極作用，美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結直腸癌指南推薦對結直腸癌患者的病理標本均應進行MMR蛋白免疫組化或微衛星不穩定（MSI）狀態檢測［7］。由于MMR蛋白免疫組化檢測對儀器和技術要求不高，開展相對容易，目前已成為結直腸癌標本的常規病理檢測內容。

然而，確保免疫組化檢測結果穩定、可靠并不是一件容易的工作。腫瘤標本需要及時固定；選擇的檢測蠟塊應該同時含有腫瘤組織和正常組織，以便進行內對照；抗原修復過程既要能充分暴露所檢測的抗原，又要避免過度修復所導致的假陽性；DAB染色時間要恰當，避免因染色不足或染色過度而影響結果判讀。隨著檢測試劑標準化和染色流程自動化，上述步驟的質量控制得到了很好的保證，極大限度地降低了因檢測環節偏差而導致的結果不確定性。

表1 MMR蛋白免疫組化結果表述不規范病例的重讀結果Table 1 Reevaluating results for the irregular interpretation of immunohistochemistry for mismatch repair proteins

表2 4個MMR蛋白免疫組化染色全陰病例的重讀結果Table 2 Reevaluating results for the patients with four mismatch repair proteins deficiency

本研究回顧了中山大學腫瘤防治中心開展MMR蛋白免疫組化檢測以來的病理報告，并對其中報告不規范的病理結果進行重讀和再評估，絕大多數患者最終得到了確切判定，僅有1例患者的MSH2蛋白因原片染色欠佳，且剩余蠟塊中已無腫瘤組織可供重染，致使結果無法判斷。臨床判讀過程中，病理醫生易出現偏差的環節總結如下：首先，病理醫生應意識到MMR免疫組化結果是二分類的，即只有陰性和陽性兩種結果，而并不存在染色強度的差別，或者陽性細胞數量的多少。其次，應注意染色質量的評估，以避免假陽性和假陰性。常規情況下，MMR蛋白在正常組織中是陽性表達的，如果出現正常內對照不表達或者表達過弱時，無論腫瘤組織染色如何，均應慎重判讀。不僅如此，MMR蛋白的表達應該是定位于細胞核，若出現胞膜或胞質染色陽性時，如本研究中部分患者出現彌漫的胞質染色，提示染色定位不準，質量欠佳。

被檢測的4個MMR蛋白中，MSH2和MSH6蛋白形成MutS α二聚體，負責識別錯配堿基并與異常DNA相結合［8］，MLH1和PMS2蛋白則形成MutL α異二聚體，在三磷腺苷（ATP）作用下修復DNA錯配［9］。其中MLH1和MSH2蛋白是MMR系統的核心蛋白，當MLH1或MSH2蛋白缺失的時候也會引起其異二聚體配對蛋白的成對缺失。然而，4個MMR蛋白全部表達缺失的現象則是極其罕見的，本研究對3例MMR蛋白染色全陰性的患者進行復核，結果顯示存在因染色問題而導致的誤判。解決這一問題最簡單、有效的辦法即設置標準外對照，選擇檢測結果確切的陽性病例和陰性病例各一例進行同時染色，通過評估對照的染色情況來判定受檢者的MMR狀態。

綜上所述，作為一項臨床開展逐漸普及的病理檢查，MMR蛋白免疫組化結果的判讀仍需要引起廣大醫務人員的重視。MMR蛋白免疫組化結果判讀存在爭議的原因主要在于以百分數形式描述、以半定量形式描述、模糊表述為+/-以及4個MMR蛋白染色結果均為陰性等情況。因此，應加強對MMR蛋白功能的認知，明確其免疫組化結果是二分類的，且極少存在4個蛋白全部表達缺失，對有疑問的染色結果及時復核，將有助于提升最終結果的準確性，更好地指導臨床診治。

圖 1 MMR蛋白免疫組化染色質量欠佳典型圖例Figure 1 Typical illustration of poor immunohistochemical staining for MMR proteins

作者貢獻：姜武、凌逸虹進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，數據整理，結果分析與解釋，撰寫論文；吳曉丹、林育珠進行數據收集；蔡木炎、丁培榮進行論文修訂；張惠忠、潘志忠、萬德森負責文章的質量控制及審校；丁培榮對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。