芒果品種遺傳多樣性及其親緣關系研究

韋再行　陸英　秦田偉　李賢宇

芒果材料的基因組遺傳復雜;利用ISSR分子標記，進行野生芒果品種資源親緣關系的研究，為我國部分野生芒果遺傳多樣性研究提供基礎，為野生芒果種質親緣關系分析，遺傳作圖，分子標記輔助育種等方面提供參考。

芒果在我國的栽培歷史悠久，種植由于起源循環途徑多樣，地方品種沒有確切的科學名稱，造成同物異名現象普遍，需建立快速高效的芒果種質資源鑒定技術工具、研究芒果種質資源的遺傳多樣性，有助于子代與親本的快速鑒別。

目前，國內外學者針對我國芒果主栽品種指紋圖譜構建研究較少，采用SSR分子標記技術對30份芒果主栽品種進行遺傳多樣性分析，以期為我國芒果主栽品種育種實踐及知識產權保護等提供參考依據，為芒果品種的DUS測試奠定技術基礎。

簡單重復序列間擴增標記是由蒙特利大學Zietkiewicz等提出的新型分子標記技術，真核生物基因組中廣泛存在由1-4個堿基對組成的簡單重復序列，ISRR分子標記是用錨定的微衛星DNA為引物，在PCR反應中，錨定引物可引起特定位點退火，用于ISSR-PCR擴增的引物通常為16-18個堿基序列，擴增的Inter-SSR區域多個條帶可通過聚丙烯苔氨凝膠電泳得以分辨。

運用ISRR標記技術時，篩選出多態性強的引物是ISSR技術的關鍵，引物的總長度為15-24bp，用于ISRR的引物常為5或3端加錨的二核普酸，四核普酸重復序列。植物基因組中最多的SRR是二核昔酸重復序列，要保證引物的Tm值靠近退火溫度，引物最好有錨定堿基，使定位更準確，數據更可靠。

目前ISRR技術在果樹遺傳育種上的應用主要包括種質資源鑒定，指紋圖譜的構建，果樹的進化與奇緣關系及目標基因定位方面。ISRR標記技術對RCR反應的敏感度比RAPD低，實驗條件的優化非常必要，ISRR引物含有重復序列，基因組內靶序列在DNA復制中存在不均交換現象，引起引物結合點之間的片斷長度差異。

ISRR以其設備重復性高，多態性豐富的特點在果樹系統分類方面發揮重大作用，ISRR分子標記技術使利用分子標記預測成為可能，通過對遺傳標記的間接選擇可分辨某些不易區分的形狀，ISRR分子標記已廣泛應用于多種果樹上，解決過去制約果樹育種周期長的問題，在果樹育種研究方面具有廣闊的前景。

1、芒果品種遺傳多樣性實驗

①實驗方法

芒果主栽品種葉片材料由農林科學院熱帶作物品種資源研究中心提供，基因組DNA提取，采集實驗材料幼葉，將濃度統一調整至20ng/μL保存備用。

根據已開發SRR標記，合成115對SSR引物，以海頓，緬甸球芒為主栽品種為材料進行引物篩選，確定條帶清晰的多態性SSR標記用于遺傳多樣性分析。PCR反映體系20.0μL包括10×Buffer2.0μL，以超純水補充至20μL，94℃預變形5min，72℃1min，72℃延伸5min，擴增產物用6%變性聚合丙烯酰胺凝膠分離電泳緩沖液為1×TBE，電泳后銀染顯色。

用Popgene計算Shannons多態指數，計算Dice遺傳相似系數，用Powermaket軟件計算SSR位點的多態性信息量。根據每對SSR引物擴增的所有差異譜帶，純合位點的等位變異數據記錄為X/X，雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，小片段在前，根據指紋圖譜出現的概率共識P=1/2n，統計圖譜的置信概率。

②實驗結果

利用改良的CTAB法可有效提取總DNA，經瓊脂糖電泳監測，基因組DNA條帶清晰，說明提取的DNA質量較好，對提取的DNA樣品進行監測，OD260/OD280可用于SSR引物的篩選。

利用115對引物對5份芒果資源進行引物篩選，利用64對引物組合對30份芒果種質進行擴增，根據SSR擴增結果，平均Shannons多態性指數為1.00，64對引物PIC變幅為0.07-0.77，引物M46的多態性對稿，所有引物中的PIC小于0.20的有4個。

利用NTsys軟件進行聚類分析，將30份芒果材料分為四類群體，第一類包括14分材料，第二類包括11分材料，第三類包括4分材料，第四類有一個品牌馬切蘇。

選出7對SSR引物構建了數字化指紋圖譜，發現引物產生標記信息可完全區分芒果品種，引物的多態性位點數為58，芒果品種中可能存在2個品種的電泳圖譜完全相同。

2總結

SSR分子標記由于具有共顯性等優點，已成為作物遺傳多樣性分析的主要方法，廣泛應用于各種作物上，在芒果種質資源遺傳多樣性研究上相對落后，使用SSR標記數目一般少于40對，本文從115對SSR標記中篩選獲得64對多態性SSR標記。

由于我國芒果資源自國外不同地方引進，從國內不同地方收集的資源不能按地域性聚集。30份芒果主栽品種第一類包含14份材料，說明品種與其他品種親緣關系較遠。第二類根據國外引進材料育成品種，第三類材料僅有4分品種，說明同一單位育出的芒果品種可能是同一父母本，鷹嘴芒與象牙22聚類結果顯示器親緣關系較近，其遺傳組分與鷹嘴芒更相似。

目前，我國芒果生產中存在同物異名的現象，利用DNA分子標記技術，對苗真實性進行鑒定不受時空的限制，能最大幅度提高品種鑒定的準確度，我國將DNA指紋圖譜鑒定作為品種質量監控的重要措施，本文建立30份中國芒果主栽品種數字指紋圖譜。

由于芒果遺傳多樣性豐富，建立了不同芒果品種的DNA指紋圖譜，利用構建的SSR分子標記指紋圖譜，可在芒果育種中合理選配親本，加快遺傳改良進程，為芒果品種群劃分提供分子遺傳學依據。

（作者單位：1.531500廣西壯族自治區田東縣義圩鎮農業服務中心;2.533000廣西壯族自治區百色市芒果研究院;3.545400廣西壯族自治區融安縣農業技術推廣中心;4.530000廣西壯族自治區土壤肥料工作站）