紅棕杜鵑（原變種）葉提取物體外抗3種皮膚真菌活性的研究

莫 全 楊勇勛

（西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615000）

皮膚癬菌病是由皮膚癬菌引起的毛發(fā)、皮膚和指（趾）甲的淺部感染，其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高，并可以在動(dòng)物之間、動(dòng)物與人之間傳播，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，且部分屬為親動(dòng)物性皮膚癬菌，特別是須毛癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌對(duì)犬、貓有重要意義，可引起斑狀脫毛癬、輪狀脫毛癬、水皰性和結(jié)痂性脫毛癬、毛囊炎[1]。臨床上表現(xiàn)極度瘙癢，脫毛形成鱗屑、毛囊破裂、潰瘍性及結(jié)節(jié)性皮炎、指甲干燥開裂質(zhì)脆且變形，3種真菌均為人蓄共患病原，人由接觸感染的犬、貓而被傳染，用西藥進(jìn)行治療價(jià)格相對(duì)較貴，并具有一定的毒副作用，臨床上現(xiàn)有的抗真菌藥物如兩性霉素B、唑類抗真菌藥等在高效低毒、抗真菌譜和耐藥性方面評(píng)價(jià)尚不太令人滿意。真菌感染的治療受到藥物安全性、真菌耐藥性及藥物效能等方面的局限[2]，因此急需研發(fā)有效的、安全無毒的、純天然的、對(duì)環(huán)境友好的植物源抑真菌劑替代化學(xué)藥劑，有利于治愈各種頑固性真菌疾病。

杜鵑花（Rhododendron simsii Planch），又稱山躑躅、山石榴、映山紅，全世界的杜鵑花約有900種，中國杜鵑花種類多、分布廣，四川涼山地區(qū)杜鵑花科植物種類多，分布范圍廣，物種資源豐富，且涼山紅棕杜鵑（原變種）還具有一些其他中醫(yī)藥不具備的獨(dú)特功能，部分種類還為特殊種[3]。目前對(duì)于杜鵑花的研究主要集中于止咳、平喘、治療慢性支氣管等疾病，據(jù)資料記載杜鵑花毒素具祛風(fēng)除濕，降低血壓，減慢心率的功效[4]，對(duì)于紅棕杜鵑（原變種）對(duì)皮膚真菌的治療暫無記錄，屬于研究的空白。從植物與微生物中研究新的生物天然抗真菌物質(zhì)是當(dāng)前開發(fā)、研制新型殺菌劑的熱點(diǎn)之一，現(xiàn)階段有關(guān)植物提取物對(duì)抗皮膚真菌的研究不多，但植物仍被認(rèn)為是化學(xué)藥劑最好的替代品，Wilkins等（1989）曾報(bào)道有1389種植物有可能作為殺菌劑[5]，植物中的抗毒素、類黃酮、有機(jī)酸以及酚類化合物均具有殺菌或抗菌活性，而杜鵑花（原變種）中富含黃酮等酚酸類成分，因此將紅棕杜鵑（原變種）提取物作用于皮膚真菌的研究與開發(fā)具有很高的價(jià)值。

1 材料

1.1 試驗(yàn)菌種

犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌三種皮膚真菌，由西昌學(xué)院攀西動(dòng)物疫病檢測(cè)與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 材料與試劑

紅棕杜鵑（原變種）葉2016年6月采集于涼山州昭覺縣七里壩，經(jīng)西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院楊勇勛副教授鑒定。葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、蒸餾水、正丁醇、二甲基亞砜、石蠟，以上藥品均由西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 紅棕杜鵑（原變種）葉各提取物的制備

將采集的涼山紅棕杜鵑（原變種）葉1kg，用清水沖洗兩遍并用蒸餾水沖洗兩遍，自然條件下通風(fēng)干燥后，用電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎成粉末，室溫下用95%的乙醇、乙酸乙酯、石油醚分別浸泡兩次，每次約24h，浸泡完成后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑，分別得到乙醇、乙酸乙酯、石油醚浸劑提取物，各取20g提取物標(biāo)記備用[6]。

2.1.2 紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇提取物各萃取相的制備

乙醇提取物除部分直接用于活性測(cè)定外，余者全部混懸于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按3比1的比例進(jìn)行萃取。萃取液分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器后，分別得到石油醚相浸膏、乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏，各取20g浸膏標(biāo)記備用[7]。

2.1.3 紅棕杜鵑（原變種）葉各提取物及乙醇提取物各萃取相溶液的配制

取紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液及乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相浸膏各2g，然后用水及適量的二甲基亞砜配制成濃度為1g/L的藥液，做好標(biāo)記供生物活性測(cè)定時(shí)使用。

2.2 抗菌活性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1.5ml藥液加入到13.5ml融化的沙氏培養(yǎng)基中（50℃左右），混勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿（直徑9.0cm）內(nèi)，制成含藥培養(yǎng)基平板，不同含藥培養(yǎng)基平板做好標(biāo)記，對(duì)照混入相同體積的二甲基亞砜與水混合物加入到13.5ml融化的沙氏培養(yǎng)基，混合均勻后倒入規(guī)格一致的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成不含藥培養(yǎng)基平板，作為空白對(duì)照組[8-9]。在已培養(yǎng)4～5d的供試菌平板上，用直徑為0.4cm的打孔器制成若干菌餅，用接種環(huán)挑取菌餅分別輕放于含藥培養(yǎng)基和非含藥培養(yǎng)基平面上（有菌絲的一面朝下），每個(gè)培養(yǎng)皿放置兩個(gè)菌餅，每組重復(fù)3次，25℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周后測(cè)定各試驗(yàn)組的菌落直徑。

2.3 計(jì)算紅棕杜鵑（原變種）葉提取物抑菌率

按下式計(jì)算紅棕杜鵑（原變種）葉提取物對(duì)供試菌的菌絲生長抑制率。

2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20. 0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抗3種皮膚真菌活性結(jié)果

從表1可以明顯看出不同極性的有機(jī)溶劑所得杜鵑（原變種）葉粗提液對(duì)3種皮膚真菌均有抑制作用，且抑制效果差別明顯，乙酸乙酯粗提液抑菌效果最佳，對(duì)石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌和須毛癬菌抑菌率分別為43.3%、49.3%、53.6%，石油醚粗提液抑菌效果最差，對(duì)抑菌率分別為28.3%、29.6%、32.4%。

表1 紅棕杜鵑（原變種）葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抑菌率

3.2 紅棕杜鵑（原變種）葉乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相抗3種皮膚真菌活性結(jié)果

從表2可以觀察出紅棕杜鵑（原變種）葉各萃取相對(duì)3種皮膚真菌均有不同程度的抑制作用，對(duì)犬小孢子菌來說，乙酸乙酯萃取相抑菌效果最佳，抑菌率為42%，正丁醇萃取相抑菌效果最弱，抑菌率為18.5%。

表2 紅棕杜鵑（原變種）葉乙酸乙酯萃取相、石油醚萃取相、正丁醇萃取相抑菌率

以上結(jié)果表明紅棕杜鵑（原變種）葉提取物對(duì)于3種皮膚真菌均有抑制作用，經(jīng)95%乙醇浸泡后正丁醇萃取所得的粗提液抑菌效果最差，乙酸乙酯粗提取液抑菌效果最佳，根據(jù)相似相溶的原理，紅棕杜鵑（原變種）葉的抗真菌成分主要存在于乙酸乙酯當(dāng)中。

4 結(jié)果與討論

皮膚癬菌可分為親動(dòng)物型與親人型，均可直接或間接引起人的皮膚癬菌病，潮濕、溫暖、不潔、擁擠的環(huán)境是造成皮膚癬菌病的主要因素，皮膚癬菌病呈世界性分布，且對(duì)動(dòng)物特別是犬、貓皮膚造成了重要傷害[10-12]。植物源藥物由于不易產(chǎn)生耐藥，是當(dāng)前抗菌藥物研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)階段對(duì)于通過植物源藥物治療皮膚真菌的記錄逐年增加，如科學(xué)家已通過提取洋蔥、竹、大蒜、大蔥、韭菜及若干種中藥中的有效成分作用于皮膚真菌，且研究結(jié)果表明有抑制作用[13]。目前杜鵑（原變種）葉的研究前景主要集中于扦插繁育方面，關(guān)于治療皮膚真菌暫無記錄。植物粗提取物成分復(fù)雜，通過不同的提取方法、提取溶劑可得到不同的有效成分，藥理作用復(fù)雜，抗真菌成分也多樣，并且受各種因素影響，因此對(duì)于植物源藥物的開發(fā)與研究需要深入且系統(tǒng)地研究[14]。

本試驗(yàn)用不同極性的紅棕杜鵑（原變種）葉提取物及萃取相對(duì)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌三種皮膚癬菌進(jìn)行體外抗真菌活性的研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示紅棕杜鵑（原變種）葉具有抑菌作用，在同一種有機(jī)溶劑中，浸泡所得粗提液抑菌效果優(yōu)于萃取相；同種提取方法中，乙酸乙酯粗提取液效果較好，乙醇粗提取液效果次之，石油醚粗提取液效果最弱。楊勇勛等人從紅棕杜鵑（原變種）乙酸乙酯粗提液中分離純化得到的植物單體─東莨菪內(nèi)酯[15]，研究表明該單體主要存在于紅棕杜鵑（原變種）當(dāng)中，具有良好的殺蟲、抗菌殺菌、殺螨、化感等生物活性[16]，這與本次試驗(yàn)當(dāng)中乙酸乙酯粗提液抗皮膚真菌效果最佳的結(jié)果相一致，且提示試驗(yàn)中主要的抗真菌成分可能為東莨菪內(nèi)酯，說明從紅棕杜鵑（原變種）中提取抗真菌活性藥物具有研究價(jià)值。此次試驗(yàn)結(jié)果為植物源抗菌藥物的研發(fā)提供了一定的參考價(jià)值，但杜鵑（原變種）葉中具有抗真菌作用的具體成分是什么，何種提取溶劑何種提取方法所得提取物的何種濃度的抑菌效果最佳，還需要進(jìn)一步研究和開發(fā)利用。