福建省譜系3 PRRSV 的分離及其ORF5 基因序列分析

魏春華，夏 偉，李 娜，馬 英，吳熠丹，虞慧云，戴愛玲，楊小燕，劉建奎

(龍巖學院生命科學學院 福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室福建省生豬疫病防控工程技術研究中心,福建 龍巖364000)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種具有高度傳染性的繁殖障礙和呼吸道疾病,該病自1987 年在美國首次報道以來,相繼在全世界范圍暴發,給世界養豬業造成巨大的經濟損失[1-4]。

PRRSV 基因組為不分節段,有囊膜的單股正鏈RNA 病毒,基因組長約15 kb,含有至少10 個開放閱讀框架(ORF)[5-7]。PRRSV 基因組存在高度的變異,Nsp2、ORF3、ORF5a 和ORF5 基因高度變異,ORF5 基因的變異情況在很大程度上可以反映PRRS 基因組的遺傳變異特征,因此國內外研究人員常以其作為靶基因研究毒株的遺傳變異[8-11]。ORF5 基因所編碼的GP5 蛋白是PRRSV 主要的中和抗原和結構蛋白之一,其良好的免疫原性能夠誘導機體產生中和抗體和細胞免疫反應,是研制PRRS 基因工程疫苗的首選。Shi 等(2010)收集8624 株ORF5 基因構建遺傳進化樹,結果顯示,PRRSV 可分為9 個譜系(lineage),每個譜系的毒株又可劃分為不同的亞型,呈現出PRRSV 遺傳多樣性[11]。我國2006 年暴發的HP-PRRSV 處于lineage 8.7,2013 年爆發的NADC30-like PRRSV 處于lineage 1。此外,我國PRRSV 還存在lineage 3(QYYZlike PRRSV)和lineage 5.1(VR-2332 like PRRSV)兩個譜系的毒株。

本試驗從福建地區采集的病料樣本中分離到1株PRRSV,通過RT-PCR、間接免疫熒光和ORF5 基因序列測定對其進行鑒定,同時測定了其在Marc-145 細胞上的TCID50,證實分離毒株FJFQ1805 為譜系3 的毒株。

1 材料與方法

1.1 豬場發病情況及樣品采集 2018 年4 月,福建省福州市某豬場疑似PRRS 感染,該場病豬臨床表現為食欲減退、精神不振,體溫升高(40 ℃～41 ℃),呼吸困難,耳朵、下腹發紺,妊娠母豬流產、早產、死胎。剖檢可見肺間質增寬,頜下、肺門、腹股溝等部位淋巴結等不同程度腫脹、充血。無菌采集病豬的肺臟、淋巴結等組織置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑 DNA Marker 2 000、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、Recombinant RNase Inhibitor(40 U/μL)、Reverse Transcriptase M-MLV 反轉錄酶(200 U/μL),購自寶生物工程(大連)有限公司；RNA 提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗鼠lgG 熒光抗體(FITC 標記)為美國Sigma 公司產品。

1.3 引物設計 按照參考文獻[12]方法設計歐洲型PRRSV ORF5 引物,引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成,擴增目的片段的大小約為700 bp。

1.4 病料的處理 將無菌采集病豬的肺臟、淋巴結等組織剪碎,充分研磨,反復凍融3 次,離心后取上清液備用。

1.5 病毒分離 將處理過的病料上清液接種于長滿單層的Marc-145 細胞,PBS 洗滌后加入適量的DMEM 維持溶液,于37 ℃恒溫條件下的CO2培養箱中培養,每天觀察細胞病變(CPE)。當細胞變圓、皺縮、細胞核固縮脫落時達到80%以上時收毒,反復冰凍融解數次。以3 000 r/min 離心10 min 后,取上清液并儲存在-70 ℃。

1.6 分離病毒的間接免疫熒光(IFA)檢測 PRRSV接種到長成單層的Marc-145 細胞的培養板中,37 ℃吸附1 h 后棄接種液,PBS 清洗后,加入適量的DMEM 維持液于每孔中,置于培養箱(37 ℃、5%CO2)中培養48 h,設正常細胞作對照。細胞出現病變后,利用冷的甲醇固定法進行固定,20 min 后棄固定液,PBS 清洗3 次,后每孔加入200 μL 稀釋的PRRSV N 蛋白鼠源單克隆抗體(MAb,1∶800),37 ℃作用2 h,PBS 輕柔的清洗3 次,將稀釋后的FITC-羊抗鼠IgG 加入每孔中,在37 ℃條件下放置1 h,PBS 清洗3次,待其干燥后倒置在熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。

1.7 TCID50的測定 將DMEM 培養基10 倍梯度稀釋的第4 代病毒(10-1～10-10)接種至已長成單層Marc-145 細胞的96 孔細胞培養板,每孔100 μL,每個梯度做4 個重復,37 ℃吸附1 h,棄去病毒液,每孔加入100 μL 維持液,置于37 ℃5%CO2繼續培養6 d,每天觀察并記錄CPE,根據Reed-Muench 方法計算TCID50。

1.8 分離病毒的ORF5 基因的RT-PCR 擴增及序列分析 病毒液RNA 的提取按照RNAsimple Total RNA Kit 抽提試劑盒說明書進行。按照說明書制備其cDNA,以其為模板進行ORF5 基因的PCR 擴增。PCR 擴增程序為:95 ℃4 min；94 ℃45 s、55 ℃45 s、72 ℃45 s,35 個循環；72 ℃10 min,同時設不加模板的陰性對照。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 擴增產物回收純化后克隆至pMD19-T 載體上,鑒定為陽性的重組菌由北京睿博興科生物技術有限公司測序。 采用DNAStar Lasergene 7.1 程序中的CLUSTAL W 程序對ORF5 基因進行多序列比對。用MEGA 6.0 軟件中的鄰近法(Neighbor-joining tree with 10,00 bootstrap)對ORF5 基因進行遺傳進化分析。

2 結果與分析

2.1 病毒接種細胞 將采集的病料樣品處理后接種Marc-145 細胞后5 d 后細胞出現聚集成叢、變圓、脫落等典型的CPE,表明分離株能夠在Marc-145 細胞上增殖(見中插彩版圖1)。

2.2 PRRSV 的間接免疫熒光鑒定結果 對分離獲得的病毒采用PRRSV N 蛋白MAb 進行間接免疫熒光檢測,結果顯示,被感染的細胞可以被抗PRRSV的特異性單抗所識別,被感染的細胞有特異性的熒光(見中插彩版圖2)。表明成功分離到了PRRSV,將分離的病毒株命名為FJFQ1805。

2.3 RT-PCR 擴增結果 分離的病毒接種細胞后經RT-PCR 擴增,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結果顯示,獲得了約為700 bp 目的片段,與預期相符(圖3),表明已經成功分離PRRSV。

圖3 PRRSV ORF5 基因PCR 擴增結果

2.4 PRRSV 分離株TCID50的測定 將10 倍梯度稀釋后的分離株FJFQ1805 的第4 代接種長滿單層Marc-145 細胞的96 孔細胞培養板,按照Reed-Muench 法計算得到該分離株的TICD50為105.3。

2.5 ORF5 基因及推導氨基酸序列的變異分析測序結果顯示,FJFQ1805 ORF5 基因核苷酸長度為603 bp,編碼200 aa。通過DNAStar Lasergene 軟件對所測序列進行比對分析,結果顯示,分離株FJFQ1805 ORF5 基因與參考毒株典毒株VR2332、CH-1a 和BJ-4 的核苷酸和推導氨基酸序列的同源性分別為83.9%～85.9%和81.0%～83.6%；與TJ、HuN4 和JXA1 等HP-PRRSV 的核苷酸和推導氨基酸序列的同源性分別為85.1%和82.5 ～82.6%；與NADC30、CHsx1401 株和FJZ03 的核苷酸和推導氨基酸序列的同源性分別為84.2%～85.6%和83.0%～85.5%；與FJFS、GM2 和QYYZ 等譜系3中PRRSV 的核苷酸和推導氨基酸序列的同源性分別為91.5%～92.2%和90.5%～92.0%；而與歐洲代表毒株LV 的核苷酸和推導氨基酸序列的同源性分別62.6%和55.1%。 結果表明,所分離的FJFQ1805 毒株為新流行的譜系3 的毒株。

2.6 ORF5 基因的遺傳進化樹分析 基于ORF5 遺傳進化分析,可將北美型PRRSV 分為4 個譜系,即以VR2332、BJ-4 為代表的譜系5.1,以CH-1a、JXwn06、JXAl 和HUN4 等為代表的譜系8.7,以NADC30、CHsx1401、FJZ03 等為代表的譜系1,以及以GM2、QYYZ 和FJFS 為代表的譜系3(圖4)。構建遺傳進化樹顯示,分離株FJFQ1805 與福建毒株FJFS 及廣東分離株QYYZ 和GM2 親緣關系較近,處于同一進化分支,而與譜系8.7、譜系5.1 和譜系1 的代表毒株處于不同的進化分支,親緣關系遠。由此表明,分離株FJFQ1805 毒株為譜系3 毒株(圖4)。

圖4 FJFQ1805 毒株與參考毒株ORF5 基因序列系統進化樹分析

2.7 ORF5 基因編碼的氨基酸序列分析 利用DNAStar Lasergene 軟件中的Megalign 程序,將所測的PRRSV GP5 序列與國內外常用的參考毒株進行序列比對分析,結果顯示,ORF5 基因編碼的氨基酸存在多處的突變,其中變異程度最大的區域為信號肽區域(aa1 ～aa25),除此之外還存在多處散在的氨基酸變異位點。GP5 蛋白胞外區aa37 ～aa45(S37H(L/F)QLIYNL45)是PRRSV 主要的中和抗原表位[13-15],其中H38和I42YN44被認為是PRRSV 中和表位的識別位點,L/F39QL41被認為是PRRSV 中和表位的結合位點[14-15]。 譜系3 中的毒株FJFS、QYYZ、GM2 和FJFQ1805 存在H38→Y38和L39→S39的變異(圖5)。PRRSV GP5 蛋白有兩個位點(R13和R151)被認為是潛在的病毒毒力相關位點。FJFQ1805 毒株存 在R13→Q13和R151→K151的 變 異。與HP-PRRSV、VR2332、NADC30 和CH-1a 相比,FJFS、QYYZ、GM2 和FJFQ1805 在第25(F/L25→S25)、26(A26→I26)、38(H38→Y38)、66(S/T66→C66)、92(A/G92→S92)、117(L117→F117)、199(R199→H199)位氨基酸發生了特征性的突變(圖5),表明譜系3的毒株與其他譜系的毒株相比發生了較大程度的變異。

圖5 PRRSV GP5 序列分析

3 討論

PRRS 已成為嚴重危害養豬業的重要疫病之一,我國自1996 年開始流行PRRS,給我國養豬業造成巨大危害,2006 年在我國南爆發的HP-PRRS,迅速蔓延至全國各地并成為我國的優勢毒株。2013年福建省開始流行NADC30-like PRRSV,為豬場防控PRRS 帶來嚴峻挑戰,2017 年lineage 3 PRRSV 呈現小范圍流行,進一步加劇了PRRS 的防控難度[16]。

本試驗對分離株FJFQ1805 和12 株參考毒株的GP5 同源性進行分析,結果顯示,FJFQ1805 與經典株(VR2332、CH-1a、BJ-4)氨基酸同源性為81.0%～83.6%；與高致病性毒株(HuN4、JXA1、TJ)氨基酸同源性為82.5%～82.6%；與NADC30-like PRRSV(NADC30、FJZ03、CHsx1401)氨基酸同源性為83.0%～85.5%；與譜系3 的毒株QYYZ、GM2 和FJFS 氨基酸同源性最高為90.5% ～92.0%。系統進化樹分析結果顯示,分離株FJFQ1805 和譜系3 中的毒株FJFS、QYYZ 和GM2處于同一進化分支,親緣關系較近,而與經典毒株、HP-PRRSV 和NADC30-like PRRSV 處于不同進化分支,親緣關系較遠,表明分離株FJFQ1805為譜系3 的毒株。

GP5 蛋白是PRRSV 的重要的結構蛋白之一,具有的良好的抗原性,可誘導機體產生中和病毒的中和抗體,而高變異的GP5 可能會影響機體抗GP5 抗體效價和交叉保護率[17-18]。與HP-PRRSV、VR2332 和CH-1a 相比,譜系3 中的毒株FJFQ1805、QYYZ、GM2 和FJFS 在第25(F/L25→S25)、26(A26→I26)、38(H38→Y38)、66(S/T66→C66)、92(A/G92→S92)、117(L117→F117)和199(R199→H199)位氨基酸發生了特征性的突變,尤其在中和表位B(S37H(L/F)QLIYNL45)存在H38→Y38和L/F39→S39的變異,這些變異可能會導致GP5 蛋白抗原性發生變化,并影響病毒與中和抗體有效的識別,從而導致病毒逃逸機體免疫應答,造成免疫失敗。

目前譜系3 的毒株在福建省呈現小范圍流行,但是該類毒株出現時間較短,病毒的來源、致病性、生物學特性等尚且不清楚,因此應當加強對該類毒株的防控,尤其是對跨地區引種或生豬貿易,應加強檢疫和生物安全,避免豬場引入新的毒株。譜系3 的毒株與現有的疫苗株RespPRRSV MLV 和HPPRRSV 疫苗株處于不同遺傳分支,親緣關系較遠,現有的弱毒疫苗是否能對其起到良好的免疫保護作用需要進一步研究。