禽流感H5、H7 和H9 亞型多重PCR 方法的建立

胡 凌，張 鵬，陳有才，張 軍，戴悅涵，胡衛(wèi)杰

(四川省自貢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川 自貢643000)

禽流感(AI)病是由正粘病毒科A 型流感病毒引起的一種急性人獸共患的傳染病,根據(jù)其HA 基因的抗原性差異可分為16 個(gè)HA 亞型,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為A 類傳染病[1-2]。此外,高致病性禽流感(HPAI)主要是由H5 或H7 兩種亞型引起的,潛伏期極短,且常不見任何臨床癥狀而突然死亡的傳染病。HPAI的發(fā)病率和病死率高達(dá)100%,并可感染人導(dǎo)致人的死亡[3,4]。 H9 亞型的禽流感病毒為低致病力的毒株,分布范圍十分廣泛,使雞群產(chǎn)生免疫抑制,如果與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等其他的病原體同時(shí)感染則對(duì)家禽的產(chǎn)蛋率、死亡淘汰率和料肉比等生產(chǎn)性能有嚴(yán)重影響。 且近十幾年來,我國的H9 亞型禽流感在呈上升趨勢(shì),嚴(yán)重的危害了我國的養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展,威脅著人類的健康,同時(shí)還影響著畜產(chǎn)品的國際貿(mào)易,給我國帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

禽流感H5、H7、H9 是我國當(dāng)前主要流行的禽流感病毒亞型,其致病性極強(qiáng),威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展,所以已在全國范圍內(nèi)引起各界學(xué)者的關(guān)注。而早期快速確診是預(yù)防和控制禽流感發(fā)生的先決條件,尤其是針對(duì)H5、H7 和H9 亞型的檢測(cè)。通過往年研究來看,對(duì)AI 的診斷和對(duì)AIV 的定型常用的方法仍是病毒的分離和血清學(xué)試驗(yàn)。但這些方法操作繁瑣復(fù)雜,效率低下,很難及時(shí)對(duì)AI 的防治提供理論支持。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是敏感性高、特異性強(qiáng),且已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要也是最基本的技術(shù)手段之一[6],而多重PCR 是一種特殊的PCR 形式,即可以在一個(gè)反應(yīng)中于短時(shí)間內(nèi)同時(shí)鑒別出多種病原體[7],該方法縮短了AIV 的檢出時(shí)間,提高了檢測(cè)效率,為AIV 的早期快速診斷提供了敏感、快速、實(shí)用的方法。本試驗(yàn)根據(jù)RT-PCR 的技術(shù)原理,采用多重PCR 檢測(cè)的技術(shù),旨在建立能夠在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)H5、H7 和H9 亞型AIV 的多重RT-PCR 檢測(cè)方法,以期為AIV的流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐,為AIV 的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株 H5 亞型病毒(re-6 株)為雞胚毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供,H7 亞型病毒、H9 亞型病毒為雞胚毒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供,新城疫病毒(NDV)、禽白血病病毒(ALV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性腔上囊病毒(IBDV)均是疫苗株,來源于商業(yè)資源。

1.2 主要試劑 RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒和MAKER,購自寶生物工程(大連)有限公司；pUC-18T 載體、TOP10 感受態(tài)細(xì)胞,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖,購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA/RNA 提取試劑盒為洛陽萊普生信息科技有限公司生產(chǎn),質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒,購自O(shè)MEGA 公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì) 參照GenBank 中登錄的H5、H7、H9 亞型毒株HA 基因序列,使用Megalign 進(jìn)行序列比對(duì),獲得保守性較強(qiáng)的區(qū)域,使用DNAStar 和Oligo 6.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì),選取合適的引物(表1)送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 擴(kuò)增目的片段的引物

1.4 核酸的提取 按說明書使用DNA/RNA 提取試劑盒分別提取H5、H7、H9 病毒核酸,獲得模板。

1.5 引物驗(yàn)證 RT-PCR 反應(yīng)在20 μL 的體系中進(jìn)行,包括2×Taq Buffer 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、酶混合液0.8 μL、ddH2O 4.7 μL、模板2.5 μL。反應(yīng)程序:50 ℃30 min；94 ℃2 min,94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃40 s,35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃10 min。取5 μL RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

1.6 測(cè)序 純化回收后的目的片段與T 載體連接后轉(zhuǎn)化到DH5α 受體菌中。陽性克隆產(chǎn)物擴(kuò)大培養(yǎng)后送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 多重RT-PCR 擴(kuò)增及優(yōu)化 以這3 種病毒重組質(zhì)粒的等比例混合物為模板,參照單重RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件,以改變某一參數(shù)且固定其他參數(shù)的方式分別對(duì)多重RT-PCR 的退火溫度(49.5 ℃～63.8 ℃),各病毒特異性引物濃度(5 μmol/L ～20 μmol/L)和循環(huán)數(shù)(25 ～40)等進(jìn)行優(yōu)化,以確定最佳反應(yīng)體系及條件,擴(kuò)增產(chǎn)物于20 g/L 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

1.8 敏感性試驗(yàn) 將提取的包含各病毒目的片段的重組質(zhì)粒用蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定濃度后,計(jì)算各病毒拷貝數(shù),用雙蒸水做10 倍系列稀釋,用已建立的多重RT-PCR 測(cè)定其敏感性。

1.9 特異性試驗(yàn) 以H5、H7、H9、NDV、ALV、REV、IBV、IBDV 核酸為模板檢測(cè)其特異性,同時(shí)隨機(jī)混合各模板進(jìn)行多重RT-PCR 反應(yīng)以測(cè)其交叉反應(yīng)性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 非同日分3 次分別提取H5、H7、H9 樣本進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增以驗(yàn)證其重復(fù)性。

1.11 多重RT-PCR 對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)108 份已通過國標(biāo)(GB/T19438-2004)驗(yàn)證檢測(cè)的臨床樣品進(jìn)行Multiplex RT-PCR 檢測(cè),并對(duì)兩者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 引物驗(yàn)證 以提取的各亞型的病毒核酸為模板,分別用各自特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果見圖1。H5、H7、H9 均擴(kuò)增出1 條清晰條帶,大小分別與預(yù)期的199 bp,341 bp 和532 bp 結(jié)果相符。

圖1 引物驗(yàn)證結(jié)果

2.2 RT-PCR 產(chǎn)物的鑒定 測(cè)序結(jié)果顯示,各特異性引物擴(kuò)增的基因序列與NCBI 上登錄的各病毒的基因序列同源性均達(dá)98%以上,表明擴(kuò)增片段分別為各自病毒的特異性條帶。

2.3 多重RT-PCR 擴(kuò)增及優(yōu)化 通過對(duì)反應(yīng)體系的摸索及條件的篩選,當(dāng)反應(yīng)總體積為20 μL,退火溫度為55 ℃,病毒特異性引物濃度均為10 μmol/L,35 個(gè)循環(huán)時(shí),其反應(yīng)是結(jié)果最佳的。

2.4 敏感性試驗(yàn) 該多重RT-PCR 反應(yīng)的最低檢測(cè)量為104拷貝/μL(圖2)。

圖2 多重RT-PCR 敏感性試驗(yàn)

2.5 特異性試驗(yàn) 在最優(yōu)反應(yīng)條件下,以H5、H7、H9、NDV、ALV、REV、IBV、IBDV 核酸為模板驗(yàn)證其特異性,該多重RT-PCR 對(duì)陽性對(duì)照擴(kuò)增目的片段,陰性樣品未擴(kuò)增出條帶,且引物間無非特異性片段產(chǎn)生(圖3)；當(dāng)隨機(jī)混和帶各病毒目的片段的重組質(zhì)粒時(shí),其產(chǎn)物也能很好的區(qū)分開來(圖4)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 非同日分3 次分別提取H5、H7、H9 單模板及多模板樣本進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增,均能擴(kuò)增出有效目的條帶,重復(fù)性良好(圖5)。

圖3 多重RT-PCR 特異性

圖4 多重RT-PCR 交叉反應(yīng)性

圖5 多重RT-PCR 重復(fù)性

2.7 臨床樣本的檢測(cè) 通過對(duì)108 份臨床樣品的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與國標(biāo)檢測(cè)結(jié)果一致,但本方法可同時(shí)檢測(cè)出3 種病原體,在節(jié)約人力、物力的同時(shí)能夠快速對(duì)臨床樣本作出診斷。見表2。

表2 單重PCR 和多重PCR 對(duì)108 份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

PCR 診斷技術(shù)自從1985 年問世至今經(jīng)過近幾十年的發(fā)展,已經(jīng)成為了醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)等領(lǐng)域中不可或缺的一種重要的科研手段,并且在疾病的診斷方面發(fā)揮了重要的作用[8]。隨著飛速發(fā)展的生物檢測(cè)技術(shù),用戶需求也基本由特異性和敏感性發(fā)展到了對(duì)操作性能與檢測(cè)性能等多層面的考量[9,10]。而多重PCR 診斷技術(shù)則是在同一個(gè)PCR 反應(yīng)的體系中加入兩對(duì)或兩對(duì)以上的特異性引物,在同一個(gè)反應(yīng)中于短時(shí)間內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的片段的PCR 反應(yīng)。其操作原理、操作過程和試劑與一般的PCR 相同,但引物設(shè)計(jì)相對(duì)于單重PCR 而言技術(shù)難度更大[11]。影響多重PCR 擴(kuò)增效果的主要因素為反應(yīng)體系和反應(yīng)條件兩大類。其中,反應(yīng)的體系包括緩沖液、引物濃度、dNTP、模板和TaqDNA 聚合酶等；反應(yīng)條件主要包括循環(huán)數(shù)和退火溫度兩方面。因此,在建立多重PCR 的反應(yīng)體系時(shí),必須對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行一連串的繁瑣的優(yōu)化[12,13]。本試驗(yàn)通過對(duì)反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的一系列優(yōu)化,最終成功建立了能在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)診斷H5、H7、H9 的RT-PCR 檢測(cè)方法。結(jié)果表明,該方法具有特異性高、敏感性強(qiáng)、快速等優(yōu)點(diǎn),且檢測(cè)的H5、H7、H9 亞型AIV 與其他禽病病原無交叉反應(yīng)性,在節(jié)約人力、物力的同時(shí)能對(duì)H5、H7、H9 快速診斷的同時(shí),為禽流感的流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支撐,為禽流感的高效防治提供了理論基礎(chǔ),對(duì)防止其傳播起到重要作用。