煙曲霉IgG抗體檢測(cè)在慢性肺曲霉病中的意義

劉揚(yáng) 李彥芹 馬秀清 解立新

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院呼吸科,北京100853

肺曲霉病是感染曲霉菌后引起的一種慢性疾病,可侵犯皮膚、黏膜、鼻腔、肺、神經(jīng)等,在各種曲霉中主要以煙曲霉為主。根據(jù)病原菌的致病力可分為致病性真菌和條件致病性真菌。致病性真菌本身具有致病性,條件致病性真菌致病性低,通常不感染正常人,但正常人大量接觸后或免疫功能低下者容易感染,煙曲霉就是其中的一種條件致病菌。根據(jù)我國(guó)目前的流行病學(xué)資料,在非血液惡性疾病患者中肺真菌病主要有肺曲霉病 (37.9%)、肺念珠菌病 (34.2%)、肺隱球菌病 (15.6%)、肺孢子菌病 (4.8%)、肺毛霉病 (2.1%)、肺馬爾尼菲藍(lán)狀菌病和組織胞漿菌病[1]。可見肺曲霉病在非血液惡性疾病患者中占有很大的比重,應(yīng)該受到重視。慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis,CPA)是一種難治的肺部疾病,發(fā)病比較緩慢,其進(jìn)程往往持續(xù)3個(gè)月以上,常合并其他呼吸疾病,如不積極治療,5 年病死率較高(75%～80%),因此需提高臨床醫(yī)師對(duì)CPA 的全面認(rèn)識(shí),以期盡早明確診斷,并給予恰當(dāng)治療,以降低其病死率。

目前上市的抗體檢測(cè)試劑盒,能檢測(cè)血清曲霉特異性IgE類抗體,僅對(duì)變應(yīng)性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)有診斷價(jià)值。國(guó)內(nèi)天津丹娜公司正在開展曲霉IgG類抗體檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn),試圖通過IgG 檢測(cè)提示疾病的發(fā)生及進(jìn)展。過去人們對(duì)曲霉抗體檢測(cè)的研究并不清楚,隨著近年來對(duì)侵襲性曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)研究的深入,尤其是對(duì)CPA 認(rèn)識(shí)的加深,以及GM 試驗(yàn)對(duì)CPA 的診斷效果不盡如人意,科研人員越來越重視曲霉菌抗體檢測(cè)在IPA 尤其是CPA 診斷中的作用[2]。在2015年出版的歐洲CPA 診斷和治療的臨床指南中[3],特別強(qiáng)調(diào)了曲霉IgG 抗體檢測(cè)、曲霉IgM 抗體檢測(cè)和曲霉IgE抗體檢測(cè)在CPA 診斷中的重要作用。2016年更新的美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(Infectious Disease Society of America,IDSA)曲霉病診斷與處置指南中,更是強(qiáng)調(diào)了曲霉IgG 抗體檢測(cè)是慢性空洞性肺曲霉病診斷中最靈敏的微生物學(xué)方法[4]。因此,為了評(píng)估其臨床診斷價(jià)值,及時(shí)的監(jiān)控患者病情并進(jìn)行及時(shí)診治,需要盡早開展此項(xiàng)檢測(cè)工作。

1 材料與方法

1.1 材料來源 2017～2018年在解放軍總醫(yī)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室復(fù)查血清煙曲霉IgG 抗體的患者血清42例,年齡 (51.8±14.5)歲,年齡范圍17～85歲,男23例,女19例。血清保存在-80 ℃冰箱。本項(xiàng)目已經(jīng)得到解放軍總醫(yī)院倫理委員的審查和批準(zhǔn)(S2017-015-01)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 天津丹娜公司生產(chǎn)的煙曲霉IgG抗體檢測(cè)試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司HQ-60旋渦混合器;北京醫(yī)用離心機(jī)廠LG10-2.4A高速離心機(jī);美國(guó)Bio Tek Instruments,Inc.ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血清煙曲霉IgG 抗體水平的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行：(1)試驗(yàn)前將試劑盒取出,置于室溫 (20～25 ℃)達(dá)30 min;(2)打開裝有酶標(biāo)板的密封袋R1,將暫不用的板條放回密封袋內(nèi)封好,保存在2～8 ℃;(3)配制工作洗滌液,濃縮洗液稀釋20倍 (1份濃縮液加19 份的無菌去離子水或超純水),稀釋后的工作洗滌液可在2～8 ℃保存2周。若濃縮洗液出現(xiàn)結(jié)晶,請(qǐng)30 ℃水浴溶解后使用;(4)樣本稀釋,待測(cè)樣本需用樣本稀釋液稀釋1 000倍 (1份樣本加999份樣本稀釋液);(5)留第一孔做空白對(duì)照,其余各孔依次加入煙曲霉IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品A、質(zhì)控品B 和稀釋后的血清樣本各100μl;(6)貼上封板膜,樣品于37 ℃條件下孵育 (60±5)min; (7)洗滌,揭開封板膜,洗滌酶標(biāo)板。每孔每次加入不少于300μl的洗滌液,靜置40 s后將酶標(biāo)板孔內(nèi)液體除去,在吸水紙上反復(fù)拍打去除殘留液體,重復(fù)上述洗滌操作,共洗滌3次;(8)每孔加入100μl酶標(biāo)抗體;(9)貼上封板膜,在37 ℃條件下孵育 (30±1)min;(10)同步驟 (7);(11)每孔加入底物溶液100μl; (12)在37 ℃條件下孵育15 min,避光;(13)每孔加入50μl終止液,加樣順序與加入底物溶液的順序一致,混勻;(14)加入終止液后,在5 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處讀吸光度值 (OD 值)。

1.4.2 結(jié)果判讀 煙曲霉IgG 抗體滴度≥120 AU/ml,則定為陽性;煙曲霉IgG 抗體滴度在80～120 AU/ml,定為可疑陽性;煙曲霉IgG抗體滴度＜80 AU/ml,則定為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)。兩組定量數(shù)據(jù)之間的比較用t檢驗(yàn),結(jié)果以±s表示,率的比較用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗真菌治療前后血清煙曲霉IgG 檢測(cè)陽性率變化 42例患者分別在3個(gè)月內(nèi)復(fù)檢煙曲霉特異性IgG 抗體。除外16例陰性患者及5例未抗真菌治療患者,余下陽性 (16例)和可疑陽性 (5例)患者21例給予伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑等抗真菌藥物治療。其中,陽性患者治療后陽性比例降至68.75%,其余31.25%轉(zhuǎn)為可疑陽性 (18.75%)或陰性 (12.5%);但是可疑陽性患者治療后,可疑陽性的比例占60%,陰性比例占20%,陽性比例占20%。陽性或者可疑陽性患者治療后轉(zhuǎn)陰比例均呈明顯增高的趨勢(shì),患者對(duì)抗真菌治療比較敏感;同時(shí)也提示該試劑盒所測(cè)陽性患者血清煙曲霉IgG 的變化能夠反映疾病的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程。

2.2 抗真菌治療前后血清煙曲霉IgG 水平的變化分別對(duì)16例陽性和5例可疑陽性患者血清煙曲霉IgG 水平進(jìn)行分析,抗真菌治療前后,分別用配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。抗真菌治療后陽性患者血清煙曲霉IgG 水平顯著下降 [(243.00±131.73)AU/ml vs(141.11±46.96)AU/ml,t=2.910,P＜0.01],差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;可疑陽性患者治療前后血清煙曲霉IgG 水平無顯著變化。表明,抗真菌治療能夠顯著降低CPA 患者血清中煙曲霉IgG 的水平,但是對(duì)可疑陽性患者效果不明顯(表1)。

表1 治療前后煙曲霉IgG 水平比較 (AU/ml,±s)

表1 治療前后煙曲霉IgG 水平比較 (AU/ml,±s)

注：與治療前比較,aP ＜0.05

組別 例數(shù) 治療前 治療后陽性組 16 243.00±131.73 141.11±46.96a可疑陽性組 5 97.39±13.55 99.10±30.16 t值 2.425 1.866P 值 0.026 0.078

2.3 陽性患者抗真菌治療前后血清煙曲霉IgG 檢測(cè)陽性率比較 治療前16例患者血清煙曲霉IgG水平＞120 AU/ml,治療后11例＞120 AU/ml,5例＜120 AU/ml。卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明,抗真菌治療后煙曲霉IgG 陽性率顯著下降 (χ2=5.926,P=0.015)。對(duì)血清煙曲霉IgG 陽性患者進(jìn)行抗真菌治療切實(shí)有效,能夠顯著降低患者血清煙曲霉IgG的陽性率。

2.4 臨床診斷肺曲霉菌感染患者抗真菌治療前后IgG 水平的比較 16 例陽性患者血清煙曲霉IgG水平＞120 AU/ml,其中12例臨床診斷為肺曲霉菌感染,對(duì)其抗真菌治療前后血清IgG 水平用配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明,抗真菌治療前IgG水平為 (263.13±146.50)AU/ml,治療后煙曲霉IgG 水平為 (150.02±49.37)AU/ml,呈顯著下降 (t=2.530,P＜0.01)。并且,治療前肺曲霉菌感染患者臨床癥狀如體質(zhì)量減輕、全身乏力、盜汗和食欲下降、及慢性咳痰、呼吸困難、胸部不適的患者 (9例)占比75%,抗真菌治療后占比 (4例)33.33%,呈顯著下降 (χ2=4.200,P=0.041)。但是抗真菌治療后患者3 個(gè)月復(fù)查肺CT,僅有2例影像學(xué)病灶較治療前縮小,10例患者治療前后影像學(xué)病灶吸收無顯著變化。臨床診斷肺曲霉菌感染患者檢測(cè)血清中IgG 水平變化的指導(dǎo)意義優(yōu)先于影像學(xué)結(jié)果。

3 討論

CPA 的診斷需同時(shí)滿足以下條件： (1)胸部影像學(xué)的特征性表現(xiàn);(2)曲霉菌感染的直接證據(jù)(顯微鏡或活組織培養(yǎng))或曲霉菌免疫反應(yīng)陽性;(3)排除其他疾病,病程超過3個(gè)月[3]。曲霉菌免疫反應(yīng)中比較常見的就是特異性IgG 抗體的檢測(cè)。IgG 是血清主要的抗體成分,約占血清Ig的75%,其中40～50%分布于血清中,其余分布在組織中。在5種免疫球蛋白中,IgG 生成的相對(duì)較晚,其持續(xù)時(shí)間也是最長(zhǎng)的,免疫球蛋白是機(jī)體受抗原 (如病原體)刺激后產(chǎn)生的,其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng),生成抗原-抗體復(fù)合物,從而阻斷病原體對(duì)機(jī)體的危害,使病原體失去致病作用,在機(jī)體免疫中起到保護(hù)作用,能有效抵抗某些感染性疾病。外源性真菌侵入肺部,引起肺的局部的炎癥反應(yīng),局部與整體互相影響,血清中煙曲霉IgG 抗體水平升高,提示患者煙曲霉菌感染,肺部真菌感染后不斷刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),其IgG 抗體一直處于比較高的水平,其濃度也會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間。

與真菌抗原檢測(cè)相比,真菌血清特異性抗體檢測(cè)的研究和臨床應(yīng)用相對(duì)滯后,其主要原因是過去人們認(rèn)為抗體檢測(cè)的特異性較差,不能區(qū)分是體內(nèi)定植還是感染;而機(jī)會(huì)性真菌感染常發(fā)生在機(jī)體免疫功能低下的人群,難以產(chǎn)生足夠量的抗體,易發(fā)生假陰性[5]。但是近年來的研究表明,定植和感染的患者其特異性抗體水平存在顯著差異;而存在免疫缺陷的患者也可以產(chǎn)生足夠的抗體水平從而用于肺部真菌感染的診斷[6]。同時(shí),隨著人們對(duì)CPA認(rèn)識(shí)的加深,真菌特異性抗體檢測(cè)已經(jīng)成為診斷的重要方法。血GM 試驗(yàn)廣泛用于IPA 的診斷,但在CPA 患者中其陽性率不高。Shin等[7]對(duì)確診為CPA 的168例患者進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)血GM 試驗(yàn)陽性率為23%,其敏感度為23%,特異度為85%,認(rèn)為血GM 試驗(yàn)不能用于CPA 的血清學(xué)診斷。本研究中,CPA 患者治療前后血清煙曲霉IgG 抗體陽性率的變化能顯示CPA 的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程,抗真菌治療能夠顯著降低CPA 患者血清中煙曲霉IgG 的水平,但是對(duì)可疑陽性患者效果不明顯 (表1),這和患者的臨床癥狀減輕或消失相符。本研究顯示,可疑陽性患者經(jīng)抗真菌治療后其煙曲霉IgG抗體水平與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以煙曲霉IgG 抗體滴度120 AU/ml為界,單獨(dú)分析16例陽性治療前后的情況,治療后與治療前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),顯示抗真菌治療對(duì)血清煙曲霉IgG 抗體滴度＞120 AU/ml的患者顯著,可疑陽性組沒有明顯效果,也就是說可疑陽性組患者抗真菌治療效果不好,這類患者可用藥也可不用。12例臨床診斷煙曲霉菌感染患者抗真菌治療后,臨床癥狀較治療前減輕,但是CPA 患者病程往往較長(zhǎng),病灶吸收緩慢,本研究12例臨床診斷患者于3個(gè)月后復(fù)查肺CT,影像學(xué)結(jié)果顯示僅有2例患者病灶較之前吸收縮小,其余10例病灶吸收無明顯變化,本研究結(jié)果提示臨床診斷煙曲霉感染患者的血清學(xué)結(jié)果優(yōu)先于影像學(xué)結(jié)果。

本研究中煙曲霉特異性IgG 抗體水平一定程度上提示了疾病進(jìn)展的程度,該試劑盒所測(cè)陽性患者血清煙曲霉IgG 陽性率的變化能夠反映疾病的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程。同時(shí)抗真菌治療后,患者臨床癥狀明顯減輕,提示抗真菌治療成功,其抗體水平也會(huì)相應(yīng)降低,進(jìn)一步證實(shí)煙曲霉特異性抗體檢測(cè)在CPA 感染中的意義,為CPA 患者的早期臨床診斷及疾病的進(jìn)展有一個(gè)很好的提示作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突