探討Xpert MTB/RIF在快速診斷初始耐藥肺結核患者中的應用

任欣欣 李志惠 馮秀莉 崔丹 趙杰

河北省胸科醫院結核一科,石家莊050041

中國是全球結核病發病率第二高的國家,僅次于印度,流行病學調查顯示,我國有近5.5億人感染結核菌,近年來發病率呈明顯升高趨勢[1]。而且由于抗菌藥物的大量應用,臨床上耐藥結核菌株出現越來越多,增加了治療難度,使患者病程延長、傳染性增強、花費增多甚至病死率升高[2]。目前診斷肺結核的方法主要包括標本抗酸染色、PPD試驗、結核菌培養和PCR 技術等[3],標本抗酸染色結果受標本質量影響大,檢出率低,PPD 試驗是簡潔檢測方法,結核菌培養需要時間長,PCR技術對標本要求高,檢出率也偏低,這些方法均存在不同程度缺陷,難以應用于早期診斷,且檢查時間跨度較大,費用高,延誤治療患者的時間,增加了患者工作生活負擔,故尋求一種快速、廉價、早期診斷結核病的方法成為本研究的熱點。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術 (rifampicinresistant real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection technology,X-pert MTB/RIF)是一種新型檢測方法[4],在檢測結核分枝桿菌基因的同時,進行利福平耐藥檢測,可以快速診斷初始耐藥結核病,并且操作簡單。故在本次研究中,對河北省胸科醫院收治的初治肺結核患者采用X-pert MTB/RIF方法診斷,分析此方的敏感度和特異度,擬為初始耐藥結核病患者的早期治療方案的制定提供依據,現將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本次研究采用全面篩查的方式,收集河北省胸科醫院2015年1月至2018年2月所有初治診斷為疑似肺結核肺患者356例,統計患者相關的臨床癥狀和表現[5],了解患者病史和治療(包括初治和復治)信息,通過臨床篩選出疑似耐多藥結核病[6](suspected drug-resistant tuberculosis,SDR-TB)患者125例以及痰涂片及臨床診斷肺結核患者231例。在所有的125例疑似MDR-TB患者中,包括23例為臨床已診斷耐藥性肺結核,35例在臨床進行常規一線抗結核治療1療程以上并且復查痰涂片未轉陰者;18例復治失敗者;12例病史中有耐藥性肺結核患者接觸和疑似傳染史。在本次研究納入的患者中,男性為189例,占53.09%;女性為167例,占46.91%。男性年齡 (53.45±10.23)歲,年齡范圍35～67 歲,女性年齡 (52.29±9.87)歲,范圍40～65歲,男女性患者一般情況差異無統計學意義 (P＞0.05),并且符合肺結核的流行性分布。本次試驗已通過倫理審查委員會批準 (20141234),所有患者知情同意。

1.2 納入標準 主要納入標準為WS288-2008肺結核診斷標準[7],其中納入患者為診斷為肺結核的患者。

1.2.1 臨床診斷病例標準 (凡符合下列項目之一者) (1)肺結核臨床表現和體征+肺部影像學典型表現;(2)肺部影像學典型表現+結核菌素試驗強陽性 [硬結平均直徑≥20 mm (兒童≥15 mm)或局部出現水皰、壞死及淋巴管炎];(3)肺部影像學典型表現+抗結核抗體檢查等其他輔助診斷方法;(4)肺部影像學典型表現+肺外組織病理檢查證實為結核病變者;(5)疑似肺結核病例經診斷性治療或隨訪觀察可排除其他肺部疾病者。

1.2.2 確診病例 痰涂片陽性肺結核診斷 (凡符合下列項目之一者)： (1)2份痰標本涂片抗酸桿菌檢查陽性;(2)1份痰標本涂片抗酸桿菌檢查陽性+肺部影像學典型表現;(3)1份痰標本涂片抗酸桿菌檢查陽性+1 份痰標本結核分枝桿菌培養陽性。

僅分枝桿菌分離培養陽性肺結核診斷：肺部影像學典型表現+痰標本涂片抗酸桿菌檢查陰性+結核分枝桿菌培養陽性。

肺部病變標本病理學診斷為結核病變者。

1.3 排除標準 (1)合并有其他全身系統疾病,或患有可能影響實驗結果的相關疾病[8];(2)在采集標本前有進行治療 (包括正規治療及自行口服抗結核藥);(3)采集標本有污染以及可能污染可能;(4)患者未簽署知情同意書。

1.4 儀器及試劑 結核菌培養+藥敏：美國BD BECTEC 960快速全自動結核菌培養及藥敏檢測系統及其試劑盒 (YZB/USA0078-2014)。

膠體金試驗 (菌型測定)：膠體金試驗試劑盒(由杭州創新生物檢控技術有限公司提供)。

X-pert MTB/RIF檢測：采用美國Cepheid公司生產的 X-pert MTB/RIF 檢測設備 (型號：GeneXpert MTB/RIF)以及試劑盒 (YZB/SWE 0657-2014)。

1.5 方法 將所有納入標本分為結核菌培養+藥敏試驗組、X-pert MTB/RIF 檢測組和 X-pert MTB/RIF檢測 (肺泡灌洗液)組。嚴格選取每例納入患者的痰液標本兩份,分為結核菌培養+藥敏試驗組和X-pert MTB/RIF檢測組,分別行結核菌培養+藥敏試驗和X-pert MTB/RIF檢測,并對結核菌培養+藥敏試驗組行膠體金試驗,結果分別納入結核菌培養+藥敏試驗組和X-pert MTB/RIF檢測組。取每例納入患者的肺泡灌洗液樣本一份,登記并行X-pert MTB/RIF 檢測,結果納入X-pert MTB/RIF檢測 (肺泡灌洗液)組。

1.5.1 結核菌培養+藥敏試驗組 將培養管內接種患者標本,然后放置于BECTEC 960快速全自動結核菌檢測儀中,置出現陽性結果后,取出樣本按藥敏試驗 (antimicrobial susceptibility test,AST)程序進行菌懸液接種,單次為0.5 ml,然后分別置于濃度為0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L 的利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇試藥管,對照組設生理鹽水稀釋菌懸液。然后放入BECTEC 960快速全自動結核菌五孔藥敏測試儀,按說明規程操作[9],在2周后每天記錄結果至5 周。膠體金試驗：對結核菌培養報陽的標本取菌液,按使用說明,結合抗酸染色法對報陽標本的菌株類型進行判斷[10](當涂片為索狀+膠體金陽性為結核分枝桿菌;當涂片為非索狀+膠體金陰性為非結核分枝桿菌)。

1.5.2 X-pert MTB/RIF 檢測組 將樣本離心后取底層液1 ml,摻入NaOH 及異丙醇處理液[11](比例為1∶2),震蕩30 s,常溫靜置15 min后去混合液置于試劑盒,然后采用X-pert MTB/RIF檢測設備全自動檢測,2 h后記錄結果。

1.5.3 X-pert MTB/RIF 檢測 (肺泡灌洗液)組操作與X-pert MTB/RIF檢測組相同。

1.6 評價指標 X-pert MTB/RIF 檢測評價[12]：MTB判讀根據DNA 擴增情況分為未檢出、極低、低、中、高五個等級。RIF藥敏結果分為檢出 (耐藥)和未檢出 (敏感)。

1.7 統計學分析 應用SPSS 17.0進行統計學分析,計數資料采用χ2檢驗,計量資料采用t檢驗,檢驗標準0.05,P＜0.05時有統計學意義,一致性檢驗采用Kappa檢驗[13],Kappa≥0.75兩者一致性較 好;0.75 ＞ Kappa≥0.4兩者一致性一般;Kappa＜0.4兩者一致性較差。計量資料以±s表示,組間比較采用成組t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納入患者試驗樣本質量 本次試驗共納入患者樣本356例,其中男189例,女167例,所有樣本均符合檢驗要求,無檢驗中交叉污染現象,檢測數據無記錄錯誤,符合實驗質量控制需要[14]。

2.2 數據評估

2.2.1 結核菌培養+藥敏法結果評價 對全部356例樣本的藥敏結果進行分析,利福平耐藥共有80例,占總數的22.47%;多菌種耐藥共有78例,占總數的21.91%;在利福平耐藥中存在兩例同時對其他藥物敏感。以 MDR-TB 的診斷標準[15]而言,利福平耐藥作為簡化指標的敏感度為100%(78/78),特異度為99.28% (276/278),陽性預測值為97.50% (78/80),陰性預測值為100%(276/276),Kappa≥0.75,兩者一致性較好,見表1。

表1 樣本耐藥情況對比 (例)

2.2.2 菌型測定結果情況 對全部356例樣本的菌型測定結果進行分析,X-pert MTB/RIF 檢測的所有樣本中,結核分枝桿菌陽性為349例,陰性為7例;以膠體金法檢測,陽性為349例,陰性為7例,若以膠體金法為判斷結核分枝桿菌的金標準[16],則X-pert MTB/RIF檢測的特異度85.71%(6/7),敏感度99.71% (348/356),陽性預測值為99.71% (348/349),陰性預測值為85.71% (6/7),Kappa≥0.75,兩者一致性較好,見表2。

表2 結核分枝桿菌檢測結果 (例)

2.2.3 耐藥度評價 對全部356例樣本的耐藥性結果進行分析,X-pert MTB/RIF 檢測的所有樣本中,耐藥性陽性為78例,陰性為278例,耐藥率為21.91%;以藥敏試驗檢測,陽性為80例,陰性為276例,耐藥率為22.47%,若以膠體金法為判斷結核分枝桿菌的金標準,則X-pert MTB/RIF檢測的特異度100% (276/276),敏感度97.50%(78/80),陽性預測值為100% (78/78),陰性預測值為99.28% (276/278),Kappa≥0.75,兩者一致性較好,見表3。

表3 耐藥性檢驗情況比較 (例)

2.2.4 痰標本與肺泡灌洗液標本的結果比較 對全部356例樣本的痰標本與肺泡灌洗液標本結果進行分析,X-pert MTB/RIF檢測的所有樣本中,痰標本耐藥性陽性為78例,陰性為278例,耐藥率為21.91%;以肺泡灌洗液檢測,陽性為79例,陰性為277例,耐藥率為22.19%,兩組數據Kappa≥0.75,一致性較好,見表4。

表4 痰標本與肺泡灌洗液標本的結果比較 (例)

2.2.5 各組標本檢測時間比較 對全部356例樣本的痰標本與肺泡灌洗液標本結果進行分析,結核菌培養+藥敏法組檢測平均時間 (19.43±2.75)d,X-pert MTB/RIF 檢測組平均時間為 (2.31±0.12)h,X-pert MTB/RIF 檢測 (肺泡灌洗液)組平均時間為 (2.37±0.19)h。X-pert MTB/RIF檢測法對痰標本和肺泡灌洗液標本檢測時間差異無統計學意義 (P＞0.05),與結核菌培養+藥敏法比較顯著縮短 (P＜0.05),見表5。

表5 各組標本檢測時間比較 (h,±s)

表5 各組標本檢測時間比較 (h,±s)

注：與結核菌培養+藥敏法組比較,aP ＜0.05

組別 例數 時間結核菌培養+藥敏法組 356 19.43±2.75 X-pert MTB/RIF檢測組 356 2.31±0.12a X-pert MTB/RIF檢測（肺泡灌洗液）組 356 2.37±0.19a F 值 17 593.64P 值 ＜0.001

3 討論

結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病,其可以侵犯人體的各個器官,但主要侵犯部位為肺部,稱之為肺結核。早期、聯合、適量、規律、全程是肺結核治療的基本原則[17],其中又以早期診斷發現為重中之重。由于肺結核表現隱匿,檢測手段局限,有時常會采用治療性診斷,這使藥物的耐藥性控制成為困難。目前的流行病學研究顯示[18],耐藥性肺結核的患者正在逐年遞增,對于MDRTB患者而言,若不能對此進行準確判斷,及時采用或更換治療方案,不僅推遲了患者的療程,也是醫療資源的極大浪費。近年來,雖然在治療的藥物并未有革命性的突破,但如新型全自動培養、基因檢測及X-pert MTB/RIF檢測正逐漸在臨床一線的快速診斷方面展露頭角,為耐藥菌的及時發現提供了更多選擇,從而使結核菌的耐藥趨勢得到了遏制。有相關的研究統計數據表明,X-pert MTB/RIF檢測在檢出結核菌的敏感度和特異度都能達到90%以上,而從2010 年開始,WHO 建議將X-pert MTB/RIF用于醫療條件不佳的國家和地區,也正是看中其檢測方便快速,準確率高等特點[19]。而在檢測時間方面,X-pert MTB/RIF 具有明顯的優勢,本次研究中X-pert MTB/RIF檢測平均時間分別為 (2.31±0.12)h和 (2.37±0.19)h,與傳統高準確率的檢測方法相比,可明顯縮短患者的診斷時間。這就使X-pert MTB/RIF的適用性不斷擴大,可以用于患者早期發現,診斷治療。

MDR-TB中存在各類耐藥菌株,而主要具有臨床實際意義的就是對傳統抗結核藥,即利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素這四種一線藥物的抗藥性,雖然傳統的體外藥敏實驗確實能夠對這四種藥物進行耐藥性檢測,但培養時間過長,有時亦不及病情發展速度,無法滿足早期診斷的要求。而近年的探針和基因芯片技術,也存在步驟復雜精細,價格昂貴等缺點,不利于大面積推廣。而X-pert MTB/RIF雖然只測利福平耐藥性,但筆者此次研究的數據結果顯示以MDR-TB 的診斷標準而言,利福平耐藥作為簡化指標的敏感度為100% (78/78),特異度為99.28% (276/278)。而國內其他相關研究的數據雖然有一些差異性[20],但基本都能在95% 以上,因此筆者認為其完全可以作為MDR-TB的快速診斷方案。

目前,臨床常用膠體金法結合抗酸染色初步判斷患者菌型,而對比X-pert MTB/RIF檢測與常規檢測的數據發現,兩者的一致性較好,而對于膠體金測試陰性的患者,筆者則進一步進行了補充基因芯片檢測,這7例中有5例為胞內分枝桿菌、1例為膿腫分枝桿菌。而在X-pert MTB/RIF 檢測陽性,膠體金測試陰性的1 例,最后檢測為雙重感染,目前推測為Rv1908基因突變或缺失所致。對于耐藥性結果的顯示,X-pert MTB/RIF 與金標準符合率高,特異度100% (276/276),敏感度97.50% (78/80),基本國外的相關研究相符。X-pert MTB/RIF以PCR 技術為基礎,檢測靶基因rpoB[21],有其獨特優點： (1)對菌株的活性無要求;(2)高敏感度和特異度;(3)結果快速。而為了探討對患者取材是否具有要求,筆者又做了補充試驗,探討不同取材對于X-pert MTB/RIF的檢測結果是否存在影響。結果基本一致,令人滿意。

綜上所述,X-pert MTB/RIF 檢測相較于傳統檢測手段優勢明顯,能夠用于初始診斷肺結核患者耐藥性的患者診斷,其敏感度和特異度都令人滿意。本次研究限于實際條件,納入的檢測手段較少,筆者后期會進一步增加檢測手段,使統計數據更為精確有效。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突