砂生槐根瘤內生細菌多樣性及其促生潛力研究

何建清 張格杰 趙偉進

摘要：以珍稀植物砂生槐為材料，對該植物根瘤內生細菌種群組成及其促生潛力進行研究，為砂生槐在荒漠化地區生態恢復與重建中的應用提供理論依據。采用YMA培養基通過平板涂布分離法分離內生細菌，通過16S rDNA序列同源性分析其遺傳多樣性，采用溶磷圈和鉬銻抗比色法測定溶磷能力，Salkowski比色法測定IAA分泌量，微量凱氏定氮法測定固氮量。結果表明，從砂生槐根瘤中分離到19株代表性內生細菌，分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）和普羅威登斯菌屬（Providencia）等5個屬，其中芽孢桿菌屬為優勢菌屬。在19株供試細菌中，7株具有良好的溶解無機磷能力，溶磷量達到 100 mg/L 以上;6株菌株具有良好的溶解有機磷能力，溶磷量達到42 mg/L以上;5株菌株具有良好的固氮能力，固定氮量達 44 mg/L 以上;3株菌株具有良好的IAA分泌能力，IAA分泌量達45 μg/mL以上。利用種子發芽指標測定高溶磷菌株的促生能力，其中菌株R24能明顯提高砂生槐種子的萌發率。綜上，西藏砂生槐根瘤內生細菌遺傳多樣性豐富，且具有良好促生能力，是重要的生物資源。

關鍵詞：砂生槐;根瘤;內生細菌;16S rDNA;促生能力

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0297-05

在研究根瘤菌與豆科植物共生關系的過程中，人們發現根瘤中同時定居著許多與根瘤菌不同的內生菌，這些非共生細菌生活在根瘤中，但不引起植物產生明顯的病害，為根瘤內生細菌[1-2]。植物內生細菌不僅將植物作為其棲息場所，而且對宿主植物有促生、防病、內生聯合固氮等廣泛的生物學作用[3-6]，根瘤內生細菌也有類似的作用[7-9]。植物內生細菌因具有多方面的生物學和生態學功能，成為潛力巨大、尚待開發的微生物新資源，受到廣泛重視[10-11]。相對于植物其他組織部位的內生細菌而言，關于根瘤內生細菌的研究相對較少。

砂生槐（Sophora moorcroftiana），別稱西藏狼牙刺、刺柴、金雀花等，藏語名吉瓦，為豆科槐屬多年生矮灌木，是青藏高原特有種[12-13]。砂生槐灌叢主要分布在雅魯藏布江流域中段的寬谷、兩側低山及拉薩河、年楚河等主要支流的寬谷內。作為典型的河谷灌叢，砂生槐具有良好的防風固沙、涵養水源等重要生態作用[14-15]。目前關于砂生槐的研究主要集中在種群和群落結構、繁殖特性、固沙特性和物種多樣性等方面[16-18]，迄今未見關于砂生槐根瘤內生細菌及其促生性的研究報道。鑒于此，本研究以西藏砂生槐根瘤為研究材料，探討砂生槐根瘤內生細菌資源多樣性及其促生潛力，為其在西藏荒漠化地區生態恢復與重建中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 根瘤的采集

2017年5—7月分別從西藏米林縣、朗縣、加查縣、林周縣、白朗縣、拉薩市、日喀則市、貢嘎縣、扎囊縣等地采集盛花期和結莢期砂生槐根瘤樣品。將采集的結瘤砂生槐根部裝入無菌自封袋中，并置于裝有冰袋的塑料泡沫箱內，帶回實驗室備用。

1.2 培養基及試劑

本研究所用的培養基參照文獻[19]配制，其中甘露醇酵母汁（YMA）培養基用于根瘤內生細菌的分離與純化;營養瓊脂（NA）培養基用于細菌的活化培養與保存;阿須貝（Ashby）無氮培養基用于固氮菌的分離及固氮能力的測定;磷酸三鈣無機磷（PKO）培養基和蒙金娜有機磷（PVK）培養基用于溶磷菌的分離及溶磷量的測定;無色氨酸King培養基[20]用于生長素分泌量的測定。S2比色液[21]。

1.3 砂生槐根瘤內生細菌的分離與純化

砂生槐根瘤內生細菌的分離與純化參照文獻[22]。首先用自來水將附著于砂生槐根瘤上的泥土沖洗干凈，放入75%乙醇中浸泡3 min，取出放入0.1%氯化汞溶液中進行表面滅菌3 min，再用無菌水洗滌5～6次，并將最后1次洗液涂布于YMA培養基上，置于28 ℃培養箱中培養2 d，若無菌落生成則表明根瘤表面消毒合格。將表面消毒合格的根瘤依次裝入盛有 0.5 mL 0.85% NaCl的離心管中，用已滅菌槍頭將其壓碎。吸取0.5 mL根瘤汁液均勻涂布于YMA培養基上，將培養皿倒置，28 ℃培養3～7 d。用劃線法進行純化，并將純化后的細菌轉接于NA斜面培養基上，4 ℃保存備用。

1.4 砂生槐根瘤內生細菌遺傳多樣性分析

用NA液體培養基將菌株培養至對數生長期，離心收集菌體，按照黃寶靈等的方法[23]提取菌株總DNA，采用16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[24]進行PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30個循環。取PCR產物在 0.7%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后回收純化測序（上海英駿生物技術有限公司），將所測得的基因序列與GenBank中的相關數據進行Blast相似性比對分析，然后用DNA分析軟件ClustalX 1.8進行多重序列比較，再用MEGA 5.0軟件通過鄰接法（neighbour-joining）建立系統進化樹。

1.5 砂生槐根瘤內生細菌促生能力研究

1.5.1 溶磷能力測定 定性測定：采用溶磷圈法測定待測菌株的溶磷能力。定量測定：采用鉬銻抗比色法定量測定上清液中有效磷的含量和pH值[25]。

1.5.2 固氮能力 定性測定：將待測菌株菌懸液涂布在Ashby無氮固體培養基上，28 ℃培養48 h后觀察生長情況。定量測定：采用微量凱氏定氮法測定菌株的固氮量。固氮量根據以下公式[26]進行計算：

N=[（V1-V2）×14×1 000]/V。

式中：V1為樣品滴定時所用的0.005 mol/L標準硫酸溶液體積，mL;V2為空白滴定時所用的0.005 mol/L標準硫酸溶液體積，mL;14為1 mmol氮的質量，mg;V為菌株培養液樣品體積，mL。

1.5.3 產IAA能力 采用Salkowski比色法[21]測定菌株分泌植物生長激素（IAA）的性能。Salkowskis（S2）比色液配制：FeCl3 4.5 g，溶于1 L 10.8 mol/L濃硫酸中。將0.3 mL菌懸液接種于盛有30 mL已滅菌無色氨酸King培養基中，在 28 ℃、150 r/min 恒溫搖床上振蕩培養7 d，12 000 r/min離心 10 min，每菌株取0.1 mL上清液滴至檢測板上，加等量S2比色液，另取比色液0.1 mL，分別加入50、30、10 mg/L標準植物生長激素0.1 mL作梯度對照，室溫靜置15 min后觀察顏色變化，確定菌株是否具有分泌IAA的能力。取能夠分泌IAA菌株的上清液1 mL加入等量S2比色液中，于黑暗中靜置30 min后用紫外分光光度計在530 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算各菌株的IAA分泌量。

1.5.4 溶磷菌對砂生槐種子萌發的影響 將溶磷能力較高的菌株接種于PVK液體培養基中，28 ℃ 200 r/min振蕩培養3 d，備用。種子在處理前先用75%乙醇溶液浸泡3 min，再用0.1% HgCl浸泡5 min，然后用無菌水沖洗5～6次。用各菌株液體浸沒砂生槐種子（標準為剛好浸沒），處理4 h后倒掉處理液，陰干。將各處理的60粒種子（每皿20粒，3次重復）均勻放入鋪有3層無菌濕潤濾紙的培養皿（直徑9 cm）中，于 25 ℃ 條件下暗培養7 d。發芽期間每天定時噴灑無菌水2次并檢查種子發芽情況，以胚根伸出種殼長度達1/2種長為發芽標準，按下列公式計算發芽率：

發芽率=7 d種子發芽數/供試種子數×100%。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離純化

通過劃線分離、革蘭氏染色鏡檢、菌落形態觀察等方法，從經表面滅菌處理的砂生槐根瘤樣品中分離純化獲得45株砂生槐根瘤內生細菌，通過形態特征和培養特征去重復后獲得19株代表菌株。

2.2 砂生槐根瘤內生細菌的遺傳多樣性分析

對19株代表性菌株的16S rDNA基因片段進行序列測定，利用NCBI中的Blast對測序結果進行同源性比對搜索，運用MEGA 5.0構建系統發育樹。從系統發育樹（圖1）可以看出，砂生槐根瘤內生細菌屬于5個不同的屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）8株、解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum）4株、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）3株、沙雷氏菌屬（Serratia）2株和普羅威登斯菌屬（Providencia）2株，其中，芽孢桿菌屬為優勢菌種，占所分離菌株的42.1%，與前人報道結果[27-28]相一致。

2.3 砂生槐內生細菌體外促生指標測定結果

2.3.1 溶磷能力測定 本試驗測定了19株在無機磷和有機磷固體培養基上培養7 d的砂生槐根瘤內生細菌的溶磷圈直徑（D）和菌落生長直徑（d），并計算了相應的D/d值。在PKO培養基上，供試的19株菌株中有7株菌株能夠產生溶磷圈，占供試菌株的36.8%，由表1可知，7株菌株的D/d值大小差異顯著，D/d值分布在1.3～3.3之間，其中菌株R1的D/d值最大，為3.3。在蒙金娜有機磷培養基上，6株菌株能夠產生溶磷圈，占供試菌株的31.6%，菌株的D/d值為 1.2～2.6（表2），其中菌株R2的D/d值最大，為2.6。為進一步確定各菌株溶磷能力的強弱，本研究利用鉬銻抗比色法定量檢測菌株溶磷能力。數據分析結果（表1、表2）顯示，在以磷酸鈣作為磷源的液體培養條件下，培養7 d后7個菌株的溶磷量為100.06～128.71 mg/L，其中菌株R1的溶磷能力最強，達128.71 mg/L，其次是菌株R21，溶磷量為 122.80 mg/L，兩者溶磷量均與菌株R8溶磷量（最小溶磷量）之間差異顯著（P<0.05）。在以卵磷脂為唯一有機磷源的液體培養條件下，6株菌株的溶磷量范圍為42.60～92.70 mg/L，其中R24具有良好的溶解有機磷能力，溶磷量達 92.70 mg/L，其次是菌株R2，溶磷量為56.72 mg/L，兩者溶磷量均與菌株R7溶磷量（最小溶磷量）之間差異顯著（P<0.05）。通過上述分析得出，R7、R8和R10能同時降解無機磷和有機磷。

從表1、表2可以看出，在溶磷培養過程中，各菌株培養液的pH值均呈下降趨勢，由最初的7.00下降到4.7～5.3之間，下降了1.7～2.3個單位。

2.3.2 固氮能力測定 利用微量凱氏定氮法測定固氮菌株的固定氮量，部分菌株表現較強的固氮能力，培養7 d固定氮量達到44 mg/L以上，菌株間的固氮能力存在顯著差異（表3）。

2.3.3 IAA分泌特性 定性檢測結果（表4）顯示，有7株菌株呈現出色澤不同的紅色顯色反應。從定量測定的結果看，菌株R17分泌IAA的能力最大，分泌量達49.22 μg/mL，與其余菌株的IAA分泌量之間具有顯著差異（P<0.05）;其次為菌株R20，IAA分泌量為48.40 μg/mL，與其余菌株的IAA分泌量之間均達到顯著差異水平（P<0.05）。IAA分泌能力的定性和定量分析結果基本一致，即在定性測驗中顯色效果明顯的菌株，對應的IAA分泌量也比較高。

2.3.4 種子發芽結果 從圖2可以看出，除菌株R2、R10處理的發芽率小于對照外，菌株R7、R8、R16、R24均具有一定的促生效應，和對照相比，對應種子發芽率分別提高了20%、40%、40%和80%。

3 結論與討論

本研究通過YMA培養基從砂生槐根瘤內分離到代表性內生細菌19株，16S rDNA序列分析結果顯示，分離自砂生槐根瘤的內生細菌分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）和普羅威登斯菌屬（Providencia），其中Bacillus屬為優勢菌群，這與代金霞等關于根瘤內生細菌的研究結果[11，28]一致。在19株內生細菌中存在一些具有高效促進植物生長的特異菌株，這些菌株及菌株組合可用于西藏荒漠化地區的土壤改良和生態恢復等。

對比定量與定性測定數據發現，溶磷圈法的準確度遠不及搖瓶復篩法，試驗中，在解無機磷細菌篩選過程中，很多在使用溶磷圈法測定時沒有溶磷能力的菌株，在復篩的過程中，發現其解磷能力較強。在解有機磷細菌篩選過程中發現，在卵磷脂平板上生長很好的菌株，放到搖瓶復篩時，其解磷能力很差，甚至沒有解磷能力，這與朱培淼等的報道[29-30]一致，因此，建議在菌株篩選過程中，通過D/d值篩選出的溶磷菌株必須通過液體培養法來進一步判斷其真實溶磷能力。

許多研究結果表明，影響根瘤菌與其宿主共生固氮的因素較為復雜，除遺傳因素起主導作用外，生態環境也有可能成為生物生存的重要調節因素[2，31-32]。陳文新等認為，根瘤菌與豆科植物之間的共生結瘤關系比較復雜，受多種因素影響，根瘤菌與豆科植物的共生關系涉及細菌、植物及環境3方面的相互作用[33]。在調查采樣中發現，并非所有地區的砂生槐都能夠結瘤，只在米林縣、朗縣和山南地區水分條件較好、由地表徑流沖刷形成的沖積溝底和兩旁灘地上的砂生槐根系中發現根瘤，而其他地區的砂生槐根系中沒有或極少著生有根瘤。這可能與青藏高原降水量少、蒸發強烈、氣候干燥、溫度較低等因素有關系，也可能與采樣時間對砂生槐不適宜有關，因此對影響砂生槐能否結瘤的因素還需進一步研究。

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