人臍靜脈內皮細胞來源外泌體有助于促進缺血性腦卒中小鼠的康復

張曉星， 胡 慧， 李躍華

上海交通大學附屬第六人民醫院放射科，上海 200233

腦卒中具有高發病率、高死亡率、高致殘率三大特點，是全球第二大死因。干細胞治療缺血性腦卒中已成為近年來的研究熱點，多種干細胞治療缺血性腦卒中具有可行性及有效性。雖然干細胞治療前景可觀，但細胞治療存在歸巢至大腦有限、引起血管栓塞等問題。外泌體是一種納米級的小囊泡，直徑30～100 nm，包含許多生物活性分子，如蛋白質、RNAs、DNAs、脂質及微小RNA，適用于功能小分子的傳遞，在細胞間的交流中起著非常關鍵的作用[1-3]。與細胞治療相比，外泌體治療因為其低免疫原性、無血管阻塞風險、能夠通過血腦屏障等而具有獨特的優勢[4-7]。研究發現，新生小鼠腦部受到缺血缺氧性損傷后，HUVECs對受損的神經元及血管內皮細胞具有保護作用[8]。干細胞向損傷的組織分泌細胞因子、生長因子、微泡等來調節受損細胞的功能，促進機體自我修復。HUVECs來源的外泌體即HUVECs-exo能促進神經干細胞增殖，減少細胞凋亡，保護成熟的神經元[9]。因此，HUVECs分泌的外泌體對促進缺血性腦卒中的恢復具有潛在價值。本研究將提取人臍靜脈內皮細胞外泌體，制備小鼠短暫性大腦中動脈閉塞(tMCAO)模型，探討HUVECs-exo能否減小缺血性卒中后的梗死范圍，促進梗死周圍區域突觸的重塑、神經及血管的新生，改善缺血性腦卒中后的神經功能恢復。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及外泌體的獲取及鑒定 ICR雄性小鼠22只，體質量25～30 g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗所用動物均經上海市第六人民醫院倫理委員會批準。

人臍靜脈內皮細胞的培養及外泌體的提取：第3代人臍靜脈內皮細胞購自ATCC美國細胞庫。經復蘇、傳代、培養，當HUVECs細胞融合度達到80%～90%時，換無血清培養基繼續培養24 h，收集HUVECs細胞上清液，并在4℃、400×g條件下進行離心，時間為20 min，去除死亡的細胞及細胞碎片。用0.22 μm濾器過濾所獲得的上清液，移至超濾管中，濃縮上清液，在4℃、4 000×g的條件下再次離心，時間為30 min，將上清液濃縮至200～300 μL，再用超速離心機進行離心，4℃、10 000×g，30 min。結束后，轉移至新的離心管，再次進行超速離心，4℃、100 000×g，70 min。結束后，去除上清液后加入PBS(15 mL)使獲得的沉淀成分溶解。用過濾器除菌后，再次離心，4℃，4 000×g，30 min，使其濃縮至200～300 μL，存放在-80℃冰箱中凍存備用。

外泌體的鑒定：NTA技術檢測外泌體粒徑，透射電鏡觀察外泌體的形態，Western印跡檢測外泌體特征性標志物CD9、CD63、CD81的表達。

1.2 小鼠大腦中動脈短暫性閉塞模型的建立 4%水合氯醛麻醉小鼠，75%乙醇消毒小鼠頭部皮膚，切開暴露小鼠的顱骨，用激光多普勒血流儀測量左側大腦中動脈供血區域的術前基礎血流，測量結束后將小鼠仰臥位固定在恒溫加熱墊上[肛溫(37±0.5)℃]；將小鼠放在顯微鏡視野下，用75%乙醇消毒小鼠頸部皮膚，做頸部正中切口，并且鈍性分離頸部皮下組織，暴露左側頸總動脈，結扎左側頸總及頸外動脈，在頸外動脈結扎處下方剪一小口，將6-0線拴插入反折至頸內動脈，當感到有輕微阻力感時，停止插入，再次用激光多普勒血流儀測量左側大腦中動脈供血區域的術后血流，術后血流降低至術前20%以下視為tMCAO造模成功。90 min后，將線栓拔出，結扎左側頸外動脈殘端，縫合皮膚，再次用激光多普勒血流儀復測皮質血流，觀察再灌注是否成功，縫合頭部皮膚，消毒，將小鼠放入籠中，待其蘇醒。

1.3 小鼠尾靜脈注射及BrdU腹腔給藥 小鼠tMCAO造模成功后24 h內外泌體尾靜脈給藥，實驗組外泌體30 μg，體積100 μL/只，對照組PBS 100 μL/只。BrdU在小鼠造模成功后連續14 d腹腔注射給藥，劑量為50 mg/kg。

1.4 小鼠行為學測試 在tMCAO造模成功后1、3、7、14、21、28 d進行神經損害嚴重程度評分(mNSS)。

1.5 小鼠磁共振掃描及腦梗死范圍的計算 小鼠tMCAO造模后第3天及28天，讓小鼠行磁共振T2序列掃描(Bruker，11.7T)，T2序列掃描參數如下，TR=2 850 ms，TE=30 ms，掃描視野=256×256，FOV=16×16，層厚=0.5 mm，層間距=0。Image J軟件計算梗死范圍。梗死范圍[10]=(對側區域-同側非梗死區域)/對側區域×100%。

1.6 Western印跡法檢測小鼠梗死周圍區域突觸素及PSD-95的表達 將小鼠斷頭取腦，獲得小鼠腦標本，將小鼠腦標本放入小鼠模具中，取梗死周圍區域的腦組織，放入蛋白裂解液中，在冰上用超聲破碎機破碎組織，勻漿后裂解30 min，后進行離心，4℃，12 000×g，30 min，獲取上清移至EP管中，放入-80℃冰箱中保存。BCA法測試蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，PVDF轉膜，10% BSA封閉后，加入相應一抗及二抗，在ECL試劑盒進行顯影。

1.7 免疫熒光雙染檢測小鼠梗死周圍區域CD31、DCX、NeuN表達 從-80℃冰箱中取出小鼠片子，室溫吹干，4%多聚甲醛固定。PBS洗滌。0.3% Triton-X100溶液破膜10 min。PBS洗滌。10% BSA封閉1 h。加一抗(CD31 1∶200，NeuN 1∶300，DCX 1∶250)，4℃孵育過夜。PBS洗滌后，避光加入熒光二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌后行DAPI染色(1∶1 000稀釋)，再次PBS洗滌，加入熒光防淬滅封片劑，封片后吹干。顯微鏡下拍照。

2 結 果

2.1 HUVECs細胞的培養 第3代HUVECs細胞購自ATCC美國細胞庫(No.CRL-1730)，按照說明書將HUVECs細胞復蘇、培養、傳代，傳代第2天可見HUVECs細胞密度較低，當融合度達到90%時，可見HUVECs細胞呈現鵝卵石樣改變，細胞生長狀態好，可進行后續實驗(圖1)。

圖1 HUVECs在不同密度下的細胞形態

2.2 外泌體的提取與鑒定 Nanosight檢測粒徑結果顯示，HUVECs-exo直徑主要為30～100 nm，極少數大于200 nm(圖2A)。Western印跡檢測到外泌體特征性標志物CD9、CD63、CD81(圖2B)。透射電鏡觀察HUVECs-exo形態呈圓形(圖2C)。

圖2 外泌體提取與鑒定

A：Nanosight檢測HUVECs-exo直徑；B：Western印跡法檢測HUVECs-exo特征性標志物CD63、CD9和CD81；C：透射電鏡觀察HUVECs-exo形態，呈圓形

2.3 HUVECs來源外泌體改善缺血性腦卒中小鼠神經功能恢復 結果顯示，在小鼠tMCAO后，PBS對照組及HUVECs-exo組神經功能評分較假手術組明顯變差，在1、3、7 d后，HUVECs-exo組小鼠神經功能較PBS對照組相比無明顯差異，但在14、21、28 d，HUVECs-exo組小鼠神經功能較PBS對照組明顯改善(表1、圖3)。

表1 各組小鼠mNSS評分 n=6,

*P<0.05與假手術組相比；△P<0.05與PBS對照組相比

圖3 各時間點假手術組、PBS對照組、HUVECs-exo組小鼠mNSS評分的比較

2.4 HUVECs來源外泌體能減少缺血性卒中后梗死范圍 在小鼠tMCAO后第3天及第28天，小鼠行磁共振T2掃描，用Image J軟件計算梗死范圍。結果顯示，在第3天，HUVECs-exo組及PBS對照組小鼠梗死范圍未見明顯差異，但在第28天發現HUVECs-exo組梗死范圍顯著小于PBS對照組(P<0.05，圖4)。

2.5 HUVECs來源外泌體促進神經元前體增殖并促進神經元的成熟 免疫熒光結果(圖5、圖6)顯示:與PBS對照組相比，HUVECs-exo組小鼠梗死邊緣區新生神經前體細胞及成熟神經元顯著增多，差異具有統計學意義(DCX：9.75±1.71vs1.0±0.82,P<0.01; NeuN:30.25±4.34vs3.25±0.50,P<0.01)。

圖4 兩組小鼠梗死范圍的比較

圖5 小鼠tMCAO后第28天DCX/BrdU免疫熒光雙染結果

圖6 小鼠tMCAO后第28天 NeuN/BrdU免疫熒光雙染結果

2.6 HUVECs來源外泌體促進小鼠腦缺血性卒中后梗死邊緣區的血管生成 免疫熒光雙染結果顯示，PBS對照組梗死周圍區的CD31+/BrdU+雙染陽性細胞數目為(3.00±0.82)個/每視野，HUVECs-exo治療組雙染陽性細胞數目為(7.00±1.83)個/每視野，HUVECs-exo組梗死邊緣區新生血管較PBS對照組顯著增多，差異具有統計學意義(P=0.015，圖7)。

圖7 小鼠tMCAO后第28天CD31/BrdU免疫熒光雙染結果

2.7 HUVECs來源外泌體促進小鼠缺血性卒中后梗死邊緣區突觸的再生 Western印跡結果顯示，與PBS對照組相比，HUVECs-exo組小鼠梗死邊緣區Synaptophysin及PSD-95的表達顯著增高(P<0.05，圖8)。

圖8 Western印跡法檢測各組小鼠梗死邊緣區Synaptophysin和PSD-95表達情況(A)及定量統計圖(B) *P<0.05

3 討 論

本研究提取且成功鑒定人臍靜脈內皮細胞外泌體，通過磁共振成像證明HUVECs來源的外泌體能夠減小缺血性腦卒中后的梗死范圍，免疫熒光結果顯示HUVECs組小鼠梗死邊緣區新生神經元數目及新生血管的數目顯著高于PBS組，說明HUVECs-exo能夠促進小鼠缺血性卒中后梗死邊緣區神經元新生及成熟并且促進血管的新生。Western印跡結果顯示，HUVECs-exo組小鼠梗死邊緣區Synaptophysin及PSD-95的表達較PBS對照組相比顯著增高，說明HUVECs-exo能夠促進突觸的重塑，與14 d后小鼠的mNSS評分相符，說明HUVECs-exo能夠促進缺血性腦卒中后的神經功能恢復。

腦梗死范圍是判斷腦功能恢復的直觀指標。本研究發現HUVECs-exo能夠減小梗死范圍。Chen等[11]通過給大鼠靜脈注射異種脂肪間充質干細胞來源的外泌體，結果顯示大鼠腦梗死的體積顯著減小。本實驗在造模成功后第3 天及第28 天后對小鼠行磁共振檢查，發現腦梗后第3天兩組小鼠的梗死范圍沒有顯著差異，但發現第28 天 HUVECs-exo組小鼠的梗死范圍較PBS對照組相比顯著減小(P<0.05)。結果說明HUVECs-exo與干細胞來源的外泌體作用相類似，能夠減小卒中后的梗死范圍，對腦卒中的治療具有一定的潛在價值。

梗死后血管新生是腦卒中預后的重要指標。熒光染色細胞計數發現，HUVECs-exo組小鼠梗死邊緣區新生血管的量顯著高于PBS對照組(P<0.05)。卒中預后與血管新生密不可分。在腦卒中慢性期可以通過新生的血管來預測卒中后腦的可塑性與功能的恢復[12]。缺血半暗帶中血管新生的數量與患者生存期的延長存在一定的相關性，這說明促進血管新生可能對腦卒中的預后有益。本研究發現，HUVECs-exo組血管新生較PBS對照組相比顯著增加，且小鼠mNSS評分逐漸改善。Yang等[13]將補陽還五湯與MSCs-exo聯合治療可以提高外泌體miR-126的表達，最終促進血管新生。本研究結果證明，與上述不同細胞來源的外泌體相類似，HUVECs-exo能夠促進缺血性腦卒中后梗死邊緣區血管生成，有利于腦卒中的恢復。

梗死邊緣區神經前體細胞及成熟神經元的多少對卒中后的恢復具有非常重要的作用。研究表明促進內源性神經發生有可能成為治療神經系統疾病一種理想的選擇[14-15]。本研究在小鼠缺血術后24 h，尾靜脈注射HUVECs-exo，術后28 d免疫熒光結果顯示DCX+/BrdU+及NeuN+/BrdU+雙陽性細胞較PBS對照組明顯增多，表明HUVECs-exo有利于缺血性腦卒中后的神經功能的恢復。Xin等[16]在大鼠缺血性卒中后24 h用MSCs來源的外泌體治療，發現其能夠改善大鼠卒中后的功能恢復，促進神經元的新生及神經突起的重塑，富含miR-17-92簇的MSCs-exo能夠通過激活PI3K/Akt/MTOR/GSK-3信號通路來促進缺血性卒中后神經功能的恢復和增強神經的可塑性。本研究與文獻報道相一致，說明HUVECs-exo能夠促進神經的發生和成熟，促進其遷移至缺血部位，具有一定治療缺血性腦卒中的潛力。

突觸重塑對缺血性腦卒中后的恢復至關重要。腦內突觸的再生和重塑與缺血性腦卒中后的認知記憶功能、運動功能及神經功能密不可分[17-18]。突觸素和PSD-95是維持突觸穩定性和可塑性的兩個重要蛋白。PSD-95是促進突觸成熟關鍵因子，它不但能調節突觸活動，還能促進突觸的穩定、完整，增加突觸的可塑性，調節突觸發揮生物學作用[19-20]。本研究中HUVECs-exo治療組在術后28 d Western印跡結果顯示PSD-95表達顯著高于PBS對照組，且與同期小鼠的mNSS評分相符。突觸素是附著在突觸前膜的一種糖蛋白，發揮重要的生物學作用，參與囊泡和質膜的融合、吞噬和再循環[21]。此外，突觸素對于神經遞質的釋放必不可少。有研究證明，突觸素減少能減低大腦突觸的可塑性[22]。本研究中術后28 d HUVECs-exo治療組在Western印跡結果顯示突觸素Synaptophysin表達也顯著高于PBS對照組，并且與同期的小鼠行為學mNSS評分相一致。因此，HUVECs-exo可以促進缺血性腦卒中后突觸的重塑。

本研究雖然證明HUVECs-exo能夠減小卒中后的梗死范圍，促進梗死邊緣區血管及神經元新生，對缺血性腦卒中后突觸重塑有益，能夠改善卒中后的神經功能預后，但仍存在諸多不足之處。第一，本研究僅選擇短暫性大腦中動脈缺血模型進行研究，下一步將與永久性腦梗死的治療效果進行比較。第二，本實驗僅選擇小鼠短暫性腦卒中后24 h進行給藥，但是進行預處理及24 h后給藥治療效果與24 h給藥效果的差異需要進一步探究，以選擇最佳治療時間及方式。第三，本實驗給藥劑量選擇30 μg，還需要進一步比較不同給藥劑量的差異，以選擇最佳給藥量。最后，本研究分子機制尚未闡明，在今后的研究中將對HUVECs來源外泌體的成分進行分析，并對梗死部位周圍新生血管形成、神經及突觸相關的基因改變進行進一步的研究，為HUVECs-exo的臨床應用提供理論基礎。