黃芩苷對馬兜鈴酸誘導小鼠急性腎損傷的保護作用

賈亦臣， 楊 橙， 鄭 龍， 李佳蔚， 曾毅剛， 許 明， 朱同玉， 戎瑞明,3*

1. 復旦大學附屬中山醫院泌尿外科，上海 200032 2. 上海市器官移植重點實驗室，上海 200032 3. 復旦大學附屬中山醫院輸血科，上海 200032

馬兜鈴酸腎病是由于攝入含有馬兜鈴酸的植物或食物而引起的進行性腎小管間質中毒，最終導致終末期腎病[1]。雖然含有馬兜鈴酸的產品已在許多國家被限制使用，但馬兜鈴酸腎病仍在世界各地大量報道，且由于目前對該疾病的認識尚不充分，其發病率可能被嚴重低估[2]。在我國，中草藥使用廣泛但成分復雜，部分含馬兜鈴酸的藥物仍在使用。2017年10月30日國家食品藥品監督管理局官方網站公布了《含馬兜鈴屬藥材的已上市中成藥品種名單》共47種、《可能含有馬兜鈴酸的馬兜鈴科藥材名單》共24種。馬兜鈴酸腎病可進展至終末期腎病，許多腎移植受者在接受腎移植前有明確的馬兜鈴酸腎病或含馬兜鈴酸藥物服用史[3]。馬兜鈴酸對腎臟損害巨大，先前研究發現，大劑量的馬兜鈴酸可在短時間內直接引起腎臟近端小管上皮細胞損傷，導致腎小管上皮細胞變性凋亡壞死[4-5]，臨床病理表現為近端小管進行性萎縮、間質明顯纖維化及快速進展為終末期腎病[3]。

黃芩苷一種是從黃芩根中分離出來的化合物，目前廣泛用于治療感染性和炎癥性疾病[6-7]。既往研究[8-10]發現，黃芩苷對急性器官損傷具有明顯的保護作用。黃芩苷可通過抑制炎性因子TNF-α、IL-6的產生并上調ZO-1的表達來保護脂多糖誘導的急性小腸上皮細胞損傷[8]；黃芩苷可通過抑制TNF-α、IL-1β等促炎性細胞因子的產生來減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷[9]；黃芩苷緩解空氣栓塞大鼠的肺毛細血管通透性、肺血管壓力及支氣管肺泡灌洗液中蛋白質濃度，且該作用與炎性因子及中性粒細胞趨化因子的減少相關[10]。基于黃芩苷對急性器官損傷的明確保護作用，本研究旨在通過建立小鼠馬兜鈴酸誘導急性腎損傷模型來探討黃芩苷對馬兜鈴酸引起的急性腎損傷的作用及其初步機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 C57小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。20～25 g雄性小鼠飼養于復旦大學附屬中山醫院SPF級動物房，自由飲水進食，動物分籠飼養，實驗前適應環境1周。該項實驗通過了復旦大學附屬中山醫院動物倫理委員會的批準。實驗中Bcl-2和Bax抗體購自Cell Signaling Technology公司，TUNEL凋亡試劑盒購自Millipore公司，馬兜鈴酸和黃芩苷購自Sigma公司。

1.2 馬兜鈴酸誘導的急性腎損傷模型 SPF級雄性C57小鼠(體質量20～25 g)，隨機分為4組，對照組：腹腔注射等量生理鹽水。模型組(即馬兜鈴酸誘導的急性腎損傷組)：腹腔注射馬兜鈴酸(10 mg/kg)。黃芩苷低劑量治療組：腹腔注射馬兜鈴酸建立急性腎損傷模型后，隨即腹腔注射黃芩苷(10 mg/kg)，此后2 d同一時間再每日給藥1次，共連續給藥3 d。黃芩苷高劑量治療組：腹腔注射馬兜鈴酸建立急性腎損傷模型后，隨即腹腔注射黃芩苷(100 mg/kg)，此后2 d同一時間再每日給藥1次，共連續給藥3 d。每組各6只小鼠，各組小鼠于模型建立后第3天通過戊巴比妥麻醉后收集心臟血及腎臟標本用于后續檢測。

1.3 腎功能檢測 各組小鼠心臟血在4 000 r/min， 4℃條件下離心10 min，并收集上層血清。后通過全自動生化分析儀檢測血清肌酐、尿素氮水平，比較各組腎功能差異。

1.4 組織病理 小鼠腎臟組織用10%甲醛溶液固定后石蠟包埋，切片機切取厚約3～5 μm白片，白片脫蠟后行H-E染色。請與該實驗無關的兩位經驗豐富的病理科醫生采用雙盲方法觀察各組H-E染色切片，并使用正置顯微鏡在每張切片上隨機取10處視野拍片(放大200倍)分析評分。根據腎臟損傷(腎小管擴張、間質擴張水腫和炎癥浸潤水平)面積進行評分(0～3分)。0分：正常腎臟(無損傷)；1分：輕度損傷 (<25% 損傷)； 2分：中度損傷 (25%～50% 損傷)； 3分：重度損傷 (>50%損傷)。

1.5 細胞凋亡檢測 小鼠腎臟組織包埋后，切片機切取厚約3～5 μm白片，白片脫蠟后按照試劑盒說明書行TUENL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP biotin nick end labeling, TUNEL)染色。凋亡細胞在200倍視野下連續觀察10個視野進行評分。

1.6 免疫印跡 采用上海碧云天生物技術有限公司的蛋白抽提試劑盒按試劑盒說明提取小鼠腎組織蛋白。Western印跡的實驗步驟如之前參考文獻[11]所描述。通過Image J軟件分析Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。

2 結 果

2.1 黃芩苷改善馬兜鈴酸引起的腎功能損傷 結果發現，與對照組相比，模型組中血肌酐和尿素氮水平明顯升高；低劑量黃芩苷治療后未見明顯改善，但高劑量黃芩苷治療后血肌酐和尿素氮水平明顯下降，且差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 各組小鼠血肌酐和尿素氮水平的對比

2.2 黃芩苷改善馬兜鈴酸引起的腎臟損傷 結果(圖2)發現：與對照組相比，模型組和黃芩苷低劑量組中可見明顯腎小管擴張(近端小管表現更為顯著)、間質擴張水腫和炎癥細胞浸潤；與模型組相比，黃芩苷高劑量組腎小管擴張、間質擴張水腫明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少。與模型組和黃芩苷低劑量組相比，腎損傷評分明顯減少，且差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組小鼠腎臟組織H-E染色及半定量評分

2.3 黃芩苷可減輕馬兜鈴酸引起的腎臟組織細胞凋亡 結果(圖3)發現：與對照組相比，模型組和黃芩苷低劑量組小鼠腎組織凋亡細胞數明顯增加；高劑量黃芩苷治療后腎組織凋亡細胞數明顯減少(P<0.05)，提示黃芩苷可減輕馬兜鈴酸引起的腎臟組織細胞凋亡。

2.4 黃芩苷改變馬兜鈴酸引起的腎臟組織中Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達 結果(圖4)發現：與對照組相比，模型組中Bax明顯升高，Bcl-2明顯降低。低劑量黃芩苷治療后未見明顯改善，但高劑量黃芩苷治療后Bax明顯降低，Bcl-2明顯升高，提示黃芩苷可改變馬兜鈴酸引起的腎臟組織中凋亡相關蛋白表達(P<0.05)。

3 討 論

含馬兜鈴酸中草藥或中成藥曾被廣泛使用，目前仍有大量馬兜鈴酸腎病病例存在[2]。馬兜鈴酸是馬兜鈴酸屬的主要次級代謝產物，具有嚴重的腎毒性[4]。隨著對馬兜鈴酸腎毒性及致癌的認識逐漸加深，近年來使用已大幅度減少，但馬兜鈴酸造成急慢性腎功能損害仍十分多見[2, 12]，部分嚴重者可快速進展為終末期腎病[3]。研究表明，馬兜鈴酸腎病主要涉及腎小管和腎小管間質[13]。單次高劑量的馬兜鈴酸可引起腎小管上皮細胞明顯凋亡壞死，導致急性馬兜鈴酸腎病[14]。

圖3 各組小鼠腎臟組織TUNEL染色及陽性細胞計數

圖4 各組小鼠腎組織促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達

本研究發現，單次注射馬兜鈴酸后小鼠腎小管明顯擴張、腎小管間質明顯擴張水腫，且腎小管上皮細胞凋亡明顯增加，腎功能明顯受損。而連續3 d通過腹腔注射100 mg/kg的黃芩苷治療馬兜鈴酸誘導小鼠急性腎損傷后，小鼠腎小管擴張程度、腎小管間質擴張水腫程度減輕，腎小管細胞凋亡減少，腎功能損傷明顯減輕。結果提示黃芩苷對馬兜鈴酸所致急性腎損傷的保護作用。 先前研究顯示，黃芩苷具有抗炎性、抗纖維化等多種重要功能。近年來，越來越多的研究也指出黃芩苷具有抑制細胞凋亡的功能。Wang等[15]研究發現，黃芩苷可增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來減少肝細胞凋亡，減輕肝損傷。Lin等[16]研究發現，向培養的人腎小管上皮細胞中加入H2O2可引起腎小管上皮細胞凋亡，而黃芩苷可通過抑制氧化應激來減輕腎小管上皮細胞凋亡。此外，Lin等[9]還發現，向缺血再灌注損傷的大鼠腹腔中注射黃芩苷后，大鼠腎臟中線粒體介導的細胞凋亡減少，腎臟缺血再灌注損傷減輕。本研究發現，黃芩苷治療馬兜鈴酸引起的急性腎損傷后，腎臟中抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加、促凋亡蛋白Bax表達減少。同時，TUENL染色也發現，與模型組相比，高劑量黃芩苷治療組中細胞凋亡數明顯減少。結果證實黃芩苷具有減輕腎臟細胞凋亡的作用。本研究發現，黃芩苷可通過減少腎臟細胞凋亡來減輕馬兜鈴酸誘導的急性腎損傷。但對于黃芩苷減少馬兜鈴酸引起的細胞凋亡的具體調控機制仍有待進一步研究。

在我國，中醫藥群眾基礎深厚，許多中草藥或中成藥確有療效，仍在廣泛使用[17]。但因中草藥成分復雜，導致許多含馬兜鈴酸的藥物仍在使用。這部分患者在獲取相關中草藥療效的同時，也在承受其帶來的嚴重不良反應。本研究證明黃芩苷可通過減少腎臟細胞凋亡來減輕馬兜鈴酸誘導的急性腎損傷。可考慮將黃芩苷與含馬兜鈴酸的中草藥或中成藥配伍使用，減輕馬兜鈴酸導致的腎損傷。