氯胺酮體外對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面腦保護(hù)相關(guān)受體表達(dá)的影響

劉邱阿雪， 凌曉敏， 方 芳， 倉 靜

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海 200032

近年來，缺血缺氧造成的腦組織損傷由于發(fā)生率高、預(yù)后差而備受關(guān)注。以腦卒中為例，美國2007年流行病學(xué)資料顯示，腦卒中發(fā)病率僅次于心臟疾病及癌癥；每年約有100萬例卒中相關(guān)病例，其中50萬例為新發(fā)病例，20萬例為復(fù)發(fā)病例，24萬例為短暫性腦缺血發(fā)作[1]。除腦卒中外，腦缺血缺氧亦是先兆性偏頭痛、癲癇、腦外傷及腦出血等疾病的病理生理基礎(chǔ)，與這些疾病的預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。

皮質(zhì)擴(kuò)散性抑制(cortical spreading depression，CSD)是缺血性腦病中神經(jīng)損傷發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；臨床和離體實(shí)驗(yàn)證據(jù)均提示，氯胺酮可通過抑制CSD的發(fā)生而降低癥狀的嚴(yán)重程度及發(fā)生頻率，從而改善缺血缺氧性腦病的預(yù)后[4-7]。而氯胺酮作為一種在臨床麻醉中被廣泛應(yīng)用的靜脈麻醉藥物，具有非競(jìng)爭(zhēng)性阻斷N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受體的作用。此外，氯胺酮還對(duì)谷氨酸受體、Na+-K+泵、鈣離子通道及乙酰膽堿受體有阻斷作用，對(duì)阿片類受體有激動(dòng)作用，亦可以阻斷5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素的重吸收[8]。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)，在Na+-K+泵等[9]表面受體、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associated protein-43，GAP-43)[10]及以谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glial glutamate transporter 1，GLT-1)[11]為主要代表的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(excitatory amino acid transporters，EAAT)的參與下，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)CSD發(fā)揮促進(jìn)和抑制的雙重作用[12-13]。然而，氯胺酮對(duì)CSD是否通過星形膠質(zhì)細(xì)胞及其表面的受體等發(fā)揮作用，尚不確切。

星形膠質(zhì)細(xì)胞可在腦損傷的急性缺血期及延遲性神經(jīng)潰變中保護(hù)神經(jīng)元[14]，減輕CSD的擴(kuò)散波強(qiáng)度[9]，幫助CSD造成的受損神經(jīng)元及神經(jīng)組織重建[15]。在生理情況下以及腦損傷發(fā)生早期細(xì)胞外鉀離子濃度升高時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過Na+-K+泵等表面受體將細(xì)胞外積聚的鉀離子運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)中和[9]；同時(shí)，由GAP-43蛋白形成的星形膠質(zhì)細(xì)胞間隙亦可以通過細(xì)胞間聯(lián)系，發(fā)揮中和過多鉀離子的作用[10]。過量谷氨酸在細(xì)胞外堆積的快速消除主要依賴于EAAT。目前已發(fā)現(xiàn)的5種EAAT中，主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的EAAT2(即GLT-1)承擔(dān)腦內(nèi)約90%的谷氨酸攝取功能[11]。

本研究以離體培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)探究消旋體氯胺酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面3種腦保護(hù)相關(guān)蛋白Na+-K+泵、GAP-43和GLT-1的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，本研究選取非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體阻滯劑MK-801和選擇性競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體阻滯劑AP-5作為對(duì)照組，以探討氯胺酮在離體培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用是否與NMDA受體有關(guān)及其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與純度檢驗(yàn) 將新生SD大鼠(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)進(jìn)行全身消毒后，在無菌條件下斷頭取腦，并在顯微鏡下分離腦皮質(zhì)。將腦組織剪成體積約0.1 mm3的碎組織塊，用胰蛋白酶消化15 min。用10% DMEM培養(yǎng)液反復(fù)重懸組織懸液，并收集過濾上清液。以850 r/min離心5 min，棄上清液，并重懸后鋪板。24 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并全量換液，此后每3 d全量換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，置于溫度37℃、轉(zhuǎn)速300 r/min的條件下，振搖培養(yǎng)板6 h。吹打后全量換液，細(xì)胞培養(yǎng)至第12天，棄去培養(yǎng)液，洗滌、固定及打孔后，用PBS按1∶200稀釋偶聯(lián)有FITC的細(xì)胞GFAP抗體(anti-GFAP,美國Santa Cruz公司)，每孔加入200 μL，避光4℃條件下孵育過夜。用PBS按1∶10 000稀釋熒光染料DAPI(用于染色細(xì)胞核)，每孔加入200 μL，避光室溫下孵育30 min。應(yīng)用Nikon Ti-s 倒置熒光顯微鏡觀察免疫熒光顯色結(jié)果。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 取培養(yǎng)至第12天、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，分組如下：(1)空白對(duì)照組，即細(xì)胞未經(jīng)任何藥物處理；(2)氯胺酮組，即用100 μmol/L消旋體氯胺酮處理細(xì)胞15 min、30 min、2 h、6 h和24 h；(3)MK-801對(duì)照組，即用1 μmol/L MK-801處理細(xì)胞15 min、30 min、2 h、6 h和24 h；(4)AP-5對(duì)照組，即用50 μmol/L AP-5處理細(xì)胞15 min、30 min、2 h、6 h和24 h。各組細(xì)胞處理后，分別采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞表面Na+-K+泵、GAP-43和GLT-1蛋白的表達(dá)情況，并用比色法檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)漏出率。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白并使用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(中國凱基生物公司)進(jìn)行蛋白定量，應(yīng)用SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)公司)制備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)所測(cè)得蛋白濃度在每一泳道中加入合適體積的目標(biāo)蛋白樣品(使目標(biāo)蛋白含量為120 μg)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，將所得NC膜根據(jù)目標(biāo)條帶位置剪裁為合適大小后，分別置入配制好的Rabbit anti-EAAT2(英國Abcam公司)、Rabbit anti-Na+-K+ATPase(美國Millipore公司)、Mouse anti-Connexin-43(美國BD Bioscience公司)一抗溶液中孵育過夜后，慢搖床孵育相應(yīng)二抗(抗兔二抗和抗鼠二抗均購自中國碧云天生物技術(shù)公司)45 min，洗膜后使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)進(jìn)行信號(hào)顯影。

1.4 藥物的細(xì)胞毒性作用檢測(cè) 取培養(yǎng)至第12天、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液。加藥時(shí)間以換液后24 h作為藥物處理終點(diǎn)時(shí)間逆推。實(shí)驗(yàn)開始前15 min，向各處理時(shí)間所設(shè)的對(duì)照組中加入裂解液以裂解細(xì)胞。收集各孔細(xì)胞上清液， 300×g離心3 min后，取潔凈96孔板，每孔中加入80 μL上清液，每種上清液復(fù)測(cè)3個(gè)孔，并取6個(gè)空白孔各加入80 μL未使用過的、不含F(xiàn)BS的DMEM液作為背景對(duì)照。按照乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(德國Roche公司)說明書進(jìn)行反應(yīng)液和終止液處理，測(cè)定光密度(OD)值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。計(jì)算各給藥組相對(duì)于空白對(duì)照組的LDH漏出量的相對(duì)百分率，以此反映各藥物的細(xì)胞毒性。

2 結(jié) 果

2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及純度 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：大鼠腦組織細(xì)胞培養(yǎng)至第12天，生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1A)。以綠色熒光二抗標(biāo)記細(xì)胞中的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP；圖1B)，以DAPI復(fù)染細(xì)胞核(圖1C)，熒光顯微鏡下可見體外培養(yǎng)體系中95%以上為星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1D)，胞體較大、形狀不規(guī)則，細(xì)胞核明顯、折光性良好、以“鋪路石”樣外觀均勻分布。

圖1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及純度檢測(cè)

A：培養(yǎng)12 d后光鏡下細(xì)胞形態(tài)；B：免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞體分布；C：免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞核分布；D：免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)及純度. Original magnification: ×200

2.2 氯胺酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面腦保護(hù)相關(guān)受體表達(dá)的影響

2.2.1 GLT-1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明：氯胺酮處理30 min和2 h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GLT-1的表達(dá)較空白對(duì)照組增加(P<0.05)。對(duì)照藥物AP-5處理24 h后，GLT-1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；對(duì)照藥物MK-801對(duì)GLT-1表達(dá)無明顯影響。

2.2.2 Na+-K+泵 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示：氯胺酮處理15 min和30 min后，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面Na+-K+泵表達(dá)較空白對(duì)照組增加(P<0.05)。對(duì)照藥物MK-801處理6 h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面Na+-K+泵的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；對(duì)照藥物AP-5對(duì)Na+-K+泵無明顯影響。

2.2.3 GAP-43 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示:氯胺酮和對(duì)照藥物MK-801處理6 h和24 h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GAP-43的表達(dá)較空白對(duì)照組減少(P<0.05)；對(duì)照藥物AP-5對(duì)Na+-K+泵無明顯影響。

2.3 氯胺酮處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用 LDH漏出率檢測(cè)結(jié)果(圖5)表明：持續(xù)作用15 min至24 h情況下，終濃度為100 μmol/L的氯胺酮、1 μmol/L的MK-801和50 μmol/L的AP-5均對(duì)離體培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞無損傷作用。

圖2 各藥物處理不同時(shí)間后原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GLT-1的表達(dá)情況

圖3 各藥物處理不同時(shí)間后原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面Na+-K+泵的表達(dá)情況

圖4 各藥物處理不同時(shí)間后原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GAP-43表達(dá)情況

圖5 各藥物處理不同時(shí)間后原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞在基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝和鉀離子攝取等方面均與在體星形膠質(zhì)細(xì)胞相似[16]。因此，本研究選擇原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞作為研究對(duì)象。在經(jīng)氯胺酮持續(xù)處理30 min和2 h后，離體培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞表面膜蛋白GLT-1的表達(dá)量相比于空白對(duì)照組明顯增加。結(jié)果表明，氯胺酮可以通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的GLT-1受體發(fā)揮腦保護(hù)作用，但該保護(hù)作用較短，且為一過性，僅出現(xiàn)在氯胺酮持續(xù)作用時(shí)間為30 min～2 h的情況下。

為明確氯胺酮在離體培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用及其作用受體，本研究選取了兩種常見的NMDA受體阻滯劑(MK-801和AP-5)作為對(duì)照。作為最常見的非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體阻滯劑，MK-801具有與氯胺酮類似的多受體作用，其不僅可以阻斷NMDA受體，還對(duì)煙堿型乙酰膽堿受體(N型乙酰膽堿受體)、5-羥色胺受體以及多巴胺受體有阻斷作用[8]。而AP-5是一種快速起效的選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體阻滯劑。因此，本研究使用氯胺酮、MK-801和AP-5分別處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞表面GLT-1、Na+-K+泵以及GAP-43的表達(dá)。結(jié)果顯示， MK801及AP-5在持續(xù)作用24 h內(nèi)均未對(duì)GLT-1有保護(hù)性上調(diào)作用，提示氯胺酮可能一過性地通過非NMDA受體途徑上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)。此外，有研究[17]表明，慢性長(zhǎng)期使用氯胺酮對(duì)GLT-1表達(dá)有永久性的下調(diào)性損傷作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AP-5在持續(xù)作用24 h后，GLT-1表達(dá)明顯下調(diào)。因此，以上結(jié)果提示，氯胺酮作用24 h并未發(fā)生下調(diào)GLT-1的作用，可能與多途徑作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還顯示，氯胺酮持續(xù)作用15 min和30 min后，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的Na+-K+泵表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯增加； MK-801持續(xù)作用6 h后， Na+-K+泵表達(dá)也明顯增加；AP-5處理組各時(shí)間點(diǎn)， Na+-K+泵表達(dá)均未改變。這些結(jié)果提示，氯胺酮對(duì)Na+-K+泵的作用可能不依賴于NMDA受體。

研究[18]表明，細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá)是星形膠質(zhì)細(xì)胞功能正常的充分必要條件，而GAP-43是星形膠質(zhì)細(xì)胞中最主要的一種細(xì)胞間連接蛋白。本研究顯示，氯胺酮持續(xù)處理時(shí)間≥6 h時(shí)，GAP-43的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯減少。Himmelseher等[6]用神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)，終濃度為100 μmol/L的S(+)氯胺酮可以上調(diào)谷氨酸預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GAP-43的表達(dá)，且這種上調(diào)作用可以從給藥后1 h持續(xù)至給藥后7 d，但消旋體氯胺酮在相同的處理方法下并未表現(xiàn)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)或傷害作用，本研究所使用的氯胺酮為消旋體，結(jié)果與之相仿。 Viberg等[19]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，氯胺酮處理24 h后，皮質(zhì)中GAP-43蛋白表達(dá)水平下降。此外，本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，氯胺酮處理6 h后星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GAP-43蛋白表達(dá)量減少；與氯胺酮的作用相似，MK-801的持續(xù)作用并未使離體培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GAP-43的表達(dá)量增加；無論處理時(shí)間長(zhǎng)短，AP-5的處理并未對(duì)離體培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GAP-43表達(dá)有明顯的作用。

此外，本研究藥物在所選濃度和作用時(shí)間下均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用。鑒于MK-801除阻斷NMDA受體以外還可作用于多種其他受體，而AP-5是一種選擇性NMDA受體阻滯劑，提示氯胺酮可能是通過與MK-801相似或相同的途徑抑制GAP-43蛋白的表達(dá)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。而且S(+)氯胺酮對(duì)離體培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GAP-43蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用也須進(jìn)一步研究證實(shí)。

如何預(yù)防腦損傷的發(fā)生，通過干預(yù)腦組織受損程度改善腦損傷相關(guān)疾病的預(yù)后，探究腦損傷的發(fā)生機(jī)制，明確已發(fā)現(xiàn)有腦保護(hù)作用的藥物的作用機(jī)制和靶點(diǎn)途徑，均是臨床和科研工作者的關(guān)注重點(diǎn)。目前，氯胺酮的腦保護(hù)作用已在臨床層面、離體腦片層面以及細(xì)胞層面(神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型及神經(jīng)元培養(yǎng)模型)被證實(shí)，但是其具體作用途徑和機(jī)制尚不明確。本研究通過探究氯胺酮對(duì)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中與腦保護(hù)密切相關(guān)的3種蛋白的調(diào)節(jié)作用及時(shí)效性，初步分析氯胺酮作用的可能機(jī)制。本研究結(jié)果表明，消旋體氯胺酮可以一過性地通過非NMDA受體途徑，上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GLT-1和Na+-K+泵的表達(dá)，這為進(jìn)一步闡明氯胺酮潛在的腦保護(hù)作用提供了更多證據(jù)和新的思路。