PCSK9對急性胰腺炎局部并發癥及不良預后事件的預測價值

李正良， 蔡 瑜， 張順財

復旦大學附屬中山醫院消化科，上海 200032

急性胰腺炎是由于多種病因導致胰酶在胰腺內被激活，引起胰腺自身消化的疾??；輕者為胰腺水腫，重者出現胰腺出血甚至壞死；急性胰腺炎起病急驟，會引起全身炎癥反應綜合征，若出現局部和全身并發癥，則導致預后不良[1]。近年來，胰腺炎發病率呈逐漸升高的趨勢[2-3]；針對急性胰腺炎，目前臨床使用多種評分體系，如Ranson和APACHE Ⅱ評分系統；但在實際應用中，這些量表均存在缺陷[4]。因此，有必要針對胰腺炎的早期診斷、患者分層以及新疾病預后指標進行進一步研究。

無論何種病因引起的急性胰腺炎，均存在內毒素血癥[5-6]。一是膽道中細菌毒素逆行入血；二是急性胰腺炎所致有效血容量不足和內臟器官灌注不良，出現腸道上皮灌注不足，導致腸上皮細胞缺血缺氧，腸道屏障功能減弱，腸壁通透性增加，腸道細菌入血；伴隨著腸蠕動動力減弱/消失，腹腔組織間隙滲出增加可能導致腹腔內高壓，進一步造成腸道菌群轉位及內毒素血癥的發生。內毒素可與免疫細胞表面的模式識別受體結合，釋放大量炎癥因子，加劇全身炎癥反應，導致急性胰腺炎局部并發癥和預后不良[7-8]。

前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)主要由肝細胞產生，既往認為主要調節脂代謝。PCSK9通過與低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)結合，促進LDLR內吞和溶酶體途徑降解，引起高脂血癥[9]。但最近的研究[10]發現，PCSK9除了血脂水平的調控外，細菌、病毒或寄生蟲感染均可誘導其表達，促炎癥因子(LPS、TNF-α、ox-LDL)亦可促進PCSK9的合成和分泌。Walley等[14]報道了PCSK9在炎癥反應中可能的作用；Dwivedi等[12]認為PCSK9可作為LPS誘發腹膜炎大鼠模型的炎癥標志，且使用PCSK9抗體處理可提高大鼠的生存率，為腹膜炎大鼠提供了保護作用。既往研究[13]也表明姜黃素可通過抑制PCSK9表達，改善大鼠肝硬化所致腸源性內毒素血癥。但是，將PCSK9作為治療靶點能否在膿毒血癥中提供保護作用仍存在爭議[14-15]。

鑒于急性胰腺炎中存在腸道菌群轉位及內毒素血癥的現象[16]，以及LPS可促進PCSK9合成的特點，本研究擬檢測急性胰腺炎患者血清中PCSK9的濃度，隨訪PCSK9變化，并對PCSK9與患者疾病嚴重程度的相關性進行研究，以期明確PCSK9作為急性胰腺炎局部并發癥的預測價值以及PCSK9作為AP預后評價指標之一的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年5月至2018年8月復旦大學附屬中山醫院收治的急性胰腺炎患者46例，其中男性26例，女性20例，年齡29～88歲，平均(59±16.26)歲。入選標準：符合急性胰腺炎的診斷標準；患者20～90歲；既往無胰腺炎病史，本次為初發初診胰腺炎。排除標準：伴發肝臟占位或其他惡性腫瘤個人史；患者入院后24 h內簽字出院；妊娠婦女；免疫抑制疾病；近1個月內的感染性疾病病史；合并嚴重肝腎功能不全。另從同期我院擬行胃部ESD術的消化科住院患者中(病理證實非惡性腫瘤)隨機抽取40例作為陰性正常對照組。對照組患者無系統性疾病、惡性腫瘤史、急性及慢性感染，且在研究進行時無其他用藥。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準(Y2016-156)。所有研究對象知情同意且簽署知情同意書。

1.2 急性胰腺炎的診斷標準 根據2012亞特蘭大急性胰腺炎分類標準，患者病情分級：輕度、中度、重度。急性胰腺炎的局部并發癥定義為急性胰周積液、胰腺假性囊腫、急性壞死性積聚和包裹性壞死，按照患者影像學資料整理。患者病因分類定義為膽源性、高三酰甘油血癥、酒精性及其他。根據修訂版Marshall評分系統，呼吸、心血管或腎臟系統中任一系統得分≥2分即可診斷為器官衰竭。

1.3 影像學評估 通過本院電子醫療系統搜集入院急診當時CT及后續隨訪CT影像學資料及報告，CT局部并發癥的標準依照CT severity score(The Balthazar Score)的CT影像學分級定義。

1.4 預后不良事件定義 患者收治入重癥監護室ICU治療，安置小腸營養管或腸外營養，住院天數≥15 d，死亡，發生任意器官衰竭(根據Marshall評分定義)。其中，同時發生多個事件的患者也定義為預后不良。

1.5 循環中PCSK 9水平測定 患者入院當日完善診斷后，經肘靜脈抽取靜脈血2 mL，置于含EDTA的試管中，1 200×g離心10 min，取血清，-80℃冰箱保存于復旦大學附屬中山醫院中心實驗室。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)測定血清中的PCSK9水平。ELISA實驗操作嚴格按照艾博抗公司經銷的ab209884-Human PCSK9 Simple Step ELISA Kit說明書進行。同期搜集患者及對照組入院當日血檢資料。

2 結 果

2.1 各組患者一般資料的對比 結果(表1)表明：與對照組對比，急性胰腺炎患者(AP)各組年齡構成比(P=0.163 2)，性別比(P=0.959 5)差異無統計學意義?；颊呷朐寒斕煅荷统Ｒ帣z驗資料(表2)表明：患者各組PCSK9水平均與對照組相比差異存在統計學意義(P=0.018 7)。

表1 AP組與對照組基本資料比較

MAP:輕度急性胰腺炎(mild acute pancreatitis);MSAP：中度急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis)；SAP：重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis)

指 標對照組MAPMSAPSAPPCSK9 (ng/mL)30.48±5.71336.11±4.711?39.61±2.346△△42.95±1.048▲▲C-反應蛋白 (mg/L)1.772±0.683 730.03±15.3541.08±99.1295.12±78.24降鈣素原 (ng/mL)0.201 5±0.153 10.295±0.1791.524±1.0421.262±2.369白細胞計數 (×109/L)6.356±1.70412.07±2.7349.568±3.99013.69±3.729淀粉酶 (U/L)96.85±31.021 334±1 1121 515±1 359865.6±1 159脂肪酶 (U/L)25.94±13.4539.0±731.1870.6±683.9981.1±430.2白蛋白 (g/L)45.9±5.74239.78±5.01938.73±2.00541.44±3.110ALT (U/L)31.67±9.74474.44±65.16126.4±144.389.56±100.7AST (U/L)27.83±7.032103.7±113.8169.4±204.763.78±70.70TCH (mmol/L)54.2±37.66136.9±31.92141.3±36.97240.4±124.8TG (mmol/L)10.29±5.90282.75±44.03150.8±106.9566.6±758.1HDL (mmol/L)38.7±6.87645.30±22.4330.77±8.42927.76±11.60LDL (mmol/L)77.79±4.95175.20±28.3379.81±23.6593.90±30.86Lipo(α) (mg/L)144.8±96.49240.8±231.3213.0±162.665.49±60.15紅細胞計數 (×1012/L)5.089±0.400 14.507±0.594.515±0.757 94.972±0.816 1血紅蛋白 (g/L)153.9±14.02138.0±16.72136.2±25.15154.9±26.15紅細胞比容 (%)44.64±2.90241.72±4.71641.41±7.87144.16±5.284血小板計數 (×109/L)233.5±68.09219.6±98.28223.7±102.4221.8±79.79血尿素氮 (mmol/L)5.228±1.3095.844±1.2555.555±1.2395.600±2.539血清肌酐 (mmol/L)82.51±22.7661.78±9.77076.09±20.3177.67±37.21TNF-α (pg/mL)15.76±11.208.433±2.51516.09±4.08115.59±3.260IL-2R (pg/mL)419.7±160.8442.3±158.0763.6±318.2674.7±307.4IL-6 (pg/mL)4.223±5.623115.7±139.852.42±26.0667.35±54.92IL-8 (pg/mL)10.23±13.749.333±3.21523.79±3.91427.27±12.47IL-10 (pg/mL)7.337±3.7887.067±3.5809.191±3.9658.539±3.623Na+ (mmol/L)138.6±6.797140.6±3.127140.3±1.489138.2±3.623Mg2+ (mmol/L)0.858±0.111 50.835±0.0780.795 9±0.0710.903 3±0.254 3D-二聚體 (mg/L)0.374 7±0.207 82.834±2.7074.205±2.0141.866±1.940

ALT：丙氨酸氨基轉移酶；AST：門冬氨酸氨基轉移酶；TCH：血總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；Lipo(a)：脂蛋白a；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-2R：白細胞介素-2受體；IL-6：白細胞介素-6；IL-8：白細胞介素-8；IL-10：白細胞介素-10；Na+：血清鈉離子濃度；Mg2+：血清鎂離子濃度. 將患者依照亞特蘭大分類標準分層與正常對照組進行單因素的ordinary one-way ANOVA檢驗，F(3，27)=3.941，P=0.018 7，進一步的Dunnett’s multiple comparisons test多重比較結果表明，對照組與輕度(Md=-5.866，*P=0.013 9)，中度(Md=-8.757，△△P=0.003 0)和重度(Md=-10.90，▲▲P<0.000 1)胰腺炎患者差異均有統計學意義

2.2 血清PCSK9在急性胰腺炎患者組中顯著升高 結果表明，急性胰腺炎患者組血清PCSK9水平[(38.51±4.043) ng/mL]高于對照組[(30.78±4.454)ng/mL]，差異具有統計學意義(P=0.000 4)。進一步分析顯示：將患者依照亞特蘭大分類標準分層為輕度、中度和重度急性胰腺炎，與正常對照組進行單因素ordinary one-way ANOVA檢驗(P=0.018 7)，進一步的多重比較結果表明，對照組與輕度(P=0.013 9)、中度(P=0.003 0)和重度(P<0.000 1)胰腺炎患者差異有統計學意義(表2)。

2.3 血清PCSK9水平是急性胰腺炎局部并發癥發生的獨立危險因素

2.3.1 局部并發癥發生與否的單因素Logistic回歸分析 以患者病程中是否發生局部并發癥為因變量，進行單因素Logistic回歸分析顯示，PCSK9、AMY、AST、Lipo(a)、TNF-α、ALT、WBC、LDL水平是影響急性胰腺炎患者發生局部并發癥與否的主要因素；性別、年齡、病因、入院時收縮壓(systolic blood pressure, SBP)以及其余血檢資料等因素差異無統計學意義(表3)。

表3 局部并發癥單因素Logistic回歸分析

2.3.2 局部并發癥發生與否的多因素Logistic回歸分析 進一步的多因素Logistic回歸分析顯示，診斷當日血清中PCSK9水平(P=0.030，OR=1.595)是影響急性胰腺炎患者病程中局部并發癥發生的獨立危險因素，ALT水平(P=0.037，OR=0.973)是影響急性胰腺炎患者病程中局部并發癥發生的獨立保護因素(表4)。

表4 局部并發癥多因素Logistic回歸分析

2.4 d3與d10的PCSK9水平變化差值可預測預后不良相關事件

2.4.1 預后不良相關事件的Logistic單因素回歸分析 預后不良事件統計如下：收治入重癥監護室ICU治療(2例)，安置小腸營養管或腸外營養(2例)，住院天數≥15 d(14例)，死亡(1例)，發生任意器官衰竭(10例)。以患者病程中是否發生預后不良相關事件為因變量，進行單因素Logistic回歸分析顯示，PCSK9，診斷第3天血清與入院后第10天血清(d3與d10)PCSK9水平變化差值(ΔPCSK9)，入院當日血糖(Glucose)，C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)，高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)及白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)水平是影響急性胰腺炎患者發生預后不良事件的主要因素；性別、年齡、病因、血WBC、AMY及其余血檢資料等因素差異無統計學意義(表5)。

表5 預后不良事件單因素Logistic回歸分析

ΔPCSK9：診斷第3天與入院后第10天(d3與d10)患者血清PCSK9水平差值

2.4.2 預后不良相關事件的Logistic多因素回歸分析 進一步的多因素Logistic回歸分析顯示，診斷第3天血清與入院后第10天血清(d3與d10)PCSK9水平變化差值(P=0.026，OR=0.085)是急性胰腺炎患者病程中預后不良事件發生的獨立保護因素(表6)。

表6 預后不良相關事件的Logistic多因素回歸分析

2.5 PCSK9水平與伴發高脂血癥的相關性

2.5.1 PCSK9在d0與HDL及TG呈相關性 在d0，患者血清PCSK9與HDL及TG具有相關性，同時與TCH、LDL沒有相關性(表7)。

表7 患者入院時(d0)血清PCSK9水平與脂代謝

2.5.2 PCSK9在d10與TG不再具有相關性 在d10時間節點，PCSK9只與HDL在P<0.05水平具有相關性，不再與TG呈現相關性(表8)。并且無論在d0還是d10，PCSK9均未體現出與LDL的相關性。鑒于這種相關性的從有到無，可以認為，在急性胰腺炎中的PCSK9水平的升高，至少與LDL及其受體的穩態調節并非具有明確的相關性，亦不具備因果關系的條件，并且與急性胰腺炎中TG的升高也不具備直接的相關性與因果關系。

表8 患者入院后第10天(d10)血清PCSK9水平與脂代謝

3 討 論

急性胰腺炎是全身炎癥反應，其急性過程中發生的腸道菌群轉位，造成LPS入血、內毒素血癥和炎癥反應的加劇[16]。對于急性胰腺炎的血清標志，目前采用的AMY及LIP不足以單獨評估AP的嚴重程度及AP并發癥的發生率，并且對于AP預后的預測價值有限；目前使用的各種臨床評分標準亦有其局限性，尋找新的AP血清學標志和疾病預測指標很有必要。

PCSK9是LDLR相關蛋白調控子，生理作用下與脂代謝及LPS從血液循環中的清除密切相關，其水平不僅受血脂水平的調控，還被細菌、病毒等病原體感染后產生的LPS和其他炎癥因子所調控。我們以及其他學者的研究[11-14]表明將PCSK9作為目標靶點，可能對膿毒血癥有保護作用。

鑒于上述理論和工作基礎，我們推測PCSK9可能在急性胰腺炎發生和發展過程中產生一定的變化。本研究結果發現，PCSK9在急性胰腺炎患者中顯著升高；經過分層統計分析發現，PCSK9升高在MAP、MSAP及SAP均有統計學差異；進一步Logistic回歸分析顯示，PCSK9升高是急性胰腺炎局部并發癥發生的獨立危險因素，PCSK9水平在d3與d10間下降不明顯是不良預后事件發生的獨立危險因素。因此，PCSK9升高水平可以作為急性胰腺炎嚴重程度及局部并發癥的預測因素。PCSK9在患者急性胰腺炎嚴重程度分層方面可能具有潛在的作用，并且這種作用是獨立于其他常用急性炎性標志物(如CRP、ESR)以及常用的胰腺炎血清標志物AMY、LIP的。

急性胰腺炎中引起PCSK9升高的具體分子作用機制尚不明確；正常生理狀態下血清中PCSK9水平變化主要受到血脂代謝調控，然而炎癥反應過程也會導致PCSK9水平的上調[10]。在急性胰腺炎中，除了內毒素血癥外，患者還往往存在血脂代謝的紊亂，高三酰甘油血癥和高膽固醇血癥[18-19]。所以，PCSK9在急性胰腺炎中的水平變化，是受血脂代謝過程中LDLR調控的因素影響，還是和急性胰腺炎的炎癥反應相關，暫未明確。本研究統計分析顯示，PCSK9血清水平的升高在d0時間節點與HDL及TG具有相關性，同時與TCH、LDL沒有相關性，而在d10，PCSK9血清水平不再與TG具有相關性，并且在這兩個時間節點，PCSK9水平均與LDL不具備相關性，鑒于這種相關性在時間上不具備連續性，提示在急性胰腺炎中的PCSK9水平的升高，與LDL及其受體的穩態調節并不具有明確的相關性。

研究結果提示在急性胰腺炎過程中，主要是由于內毒素血癥，LPS升高，刺激肝細胞合成和分泌PCSK9增加引起的。在實際中，患者因急性胰腺炎造成PCSK9水平增高，導致肝細胞表面LDLR減少，從而造成LPS從血流中清除減少[20]，進一步導致全身炎癥反應的繼續，在胰腺局部則表現為局部并發癥的發生，在整體則表現為預后不良，整體臨床病程反復。當然，內毒素相關的反應性血脂代謝紊亂，也可能是血清PCSK9反應性升高的一種潛在可能；這需要體外實驗和動物模型去進一步驗證。

綜上所述，PCSK9可作為新的急性胰腺炎診斷的分子，對于AP局部并發癥的預測以及患者整體預后的預測有一定的作用，也可作為急性胰腺炎潛在的治療靶點，值得今后繼續研究。