對峙培養法在生防菌抑制效果研究中的應用

田書鑫，劉南南，王桂清

(聊城大學 農學院，山東 聊城 252000)

植物在生長發育和貯藏運輸過程中，遭受病原微生物的侵染引起病害是常見現象，導致農作物、蔬菜、果樹等產量降低、品質變劣，致使國家經濟遭受嚴重損失。為了降低植物病害引起的經濟損失，必須對植物病害的發生進行預防和防治，化學防治和生物防治是防控植物病害的常用方法。隨著科學技術的進步、人類生活質量的提高和對生存環境要求的提高，化學防治的弊端越來越被詬病，于是,能夠克服化學防治缺點的生物防治越來越受到重視[1]。生物防治最主要的內容之一是利用微生物進行防治。微生物農藥，包括農用抗生素和活體微生物農藥，主要是利用微生物或其代謝產物來防治危害農作物等的有害生物，而且可以促進作物生長、提高產品品質，有利于農村經濟增長和農民增收，生態效益、社會效益和經濟效益不可估量。

為了明確有益微生物或其次生代謝產物的抑(殺)菌效果和作用范圍，首先必須采用適當的方法進行抑菌活性研究，這是將其開發成微生物農藥的第一步，而對峙培養法是常用的研究方法。通過對峙培養可以明確生防菌的抑菌效果與抑菌方式，從而預估該生防菌的應用前景。為了更深入地了解對峙培養方法，對不同對峙培養方法的操作步驟、特點和適用生防菌種類等進行了總結，以期為選擇合適的方法進行抑菌活性研究提供有力依據。

1 對峙培養的意義

對峙培養是檢測供試生防菌(或代謝產物)與病原菌是否存在拮抗作用的一種方法，通過將2種菌同時培養在培養基中，或者將一系列病原菌接入含生防菌發酵液的培養基中，再采用不同的放置方法和手段培養，觀測其生長狀態，并檢查其菌絲與孢子的變化，根據抑菌圈大小、菌落直徑變化程度和病原菌形態有無變化等，最終確定生防菌對一系列病原菌抑菌能力的強弱[2]。

通過對峙培養，首先可以明確抑菌效果，即明確生防菌(包括其代謝產物，下同)對一系列真菌、細菌及其他致病菌的抑菌能力；其次可以初步了解抑菌方式，即通過對菌絲與孢子形態的觀察明確其抑菌方式，包括菌絲的競爭、纏繞或次生代謝物的刺激等。通過明確生防菌的抑菌能力與抑菌方式，可以預估該生防菌的應用前景，為進一步明確其抑菌活性物質，研究其抑菌機制，研發新的先導化合物，開發新型微生物殺菌劑奠定理論依據。

2 對峙培養的方法及應用

對峙試驗由于操作方法的不同可分為菌餅法、菌液法、劃線法和擴散法4種形式，方法不同，操作步驟、特點和適用范圍不同。

2.1 菌餅法

菌餅法是最常使用的對峙培養方法，常用于有益生防真菌和細菌的抑菌活性測定，該方法可通過觀察生防菌與病原菌的生長狀態，進一步明確生防菌的抑菌方式，如競爭、抑制、纏繞、重寄生等。該法按接種菌餅數量和放置位置又分為菌餅兩點法與菌餅多點法(Multiple fungus cake method, MFCM)，多點法又區分為3種，具體如下。

2.1.1 菌餅兩點法(Two fungus cake method，TFCM2) 菌餅兩點法是對峙試驗中操作最簡單、使用最頻繁的一種方法，僅需要將生防菌與病原菌的菌餅接種于相距20 mm以上的同一平板培養基的兩點，培養一定時間后，觀察生長情況，計算抑菌率。

木霉菌(Trichoderma)屬于半知菌類的絲孢綱叢梗孢目叢梗孢科，是一類普遍存在的、具有廣譜性的拮抗生防菌，具有適應廣泛性、寄生廣譜性、拮抗物多樣性和環境友好性等特點，已經成功地應用于植物病害等的防治。綠色木霉(T.viride)、長枝木霉(T.longibrachiatum)、哈茨木霉(T.harzianum)等生防木霉菌對棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、松枯枝病菌(Cenangiumferruginosum)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)等的拮抗作用[3-7]試驗均采用的是菌餅兩點法，證實了生防木霉菌強大的抑菌活性；在對峙培養過程中進一步通過顯微鏡觀察發現，木霉菌菌絲緊貼或者纏繞致病菌菌絲，逐漸覆蓋或深入到致病菌的菌落內部，在菌絲上生長并產孢，使致病菌菌絲被纏繞的部分出現明顯萎縮、退化，最終使菌絲斷裂、解體直至死亡[8-9]，從而明確了木霉菌的抑菌方式。

2.1.2 菌餅三點法(Three fungus cake method，TFCM3) 該方法是菌餅兩點法的延伸，操作雖然簡單，但僅限于菌體生長前期就表現出較強抑菌活性的生防菌的抑菌試驗。三點在培養皿中呈直線排列，其中，中間菌餅為生防菌，兩側為病原菌(既可以是同一種，也可以是不同種)，病原菌沿生防菌左右對稱分布。通過測量菌落直徑和抑菌圈大小，判斷生防菌的抑菌活性強弱。任飛娥[10]從土壤中分離得到95株細菌，以其中1株來源于貝母土壤的菌株BM5(多黏類芽孢桿菌，Paenibacilluspolymyxa)為測試對象，采用菌餅三點法研究了其生防作用，結果表明，該菌株對水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)具有較強的拮抗效果，對其他7種病原真菌具有一定的抑制作用，說明該菌株的生防作用具有廣譜性，開發應用前景廣闊。

2.1.3 菌餅四點法(Four fungus cake method，FFCM4) 該方法也是菌餅兩點法的延伸，此種方法可同時研究1種生防菌對幾種病原菌的抑菌活性，也可同時研究幾種生防菌對1種病原菌的抑制效果。王美琴等[11]等采用此方法，以芽孢桿菌(Bacillus)為生防菌，測定了其對多種病害致病菌的拮抗作用，最終發現其對番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和番茄葉霉病菌(Fulviafulva)的抑制效果穩定，抑菌帶明顯。

菌餅四點法的操作流程：將病原菌(或生防菌)接種于培養基中央，在其周圍3個不同位置(距離中央菌餅的距離相同)分別接上3種不同的生防菌(或病原菌)，培養一段時間后，觀察生防菌對病原菌的抑制作用。該方法同菌餅三點法一樣，適用于菌體生長前期便表現出較強抑菌活性的生防菌的活性測定。

2.1.4 菌餅五點法(Five fungus cake method，FFCM5) 五點法比上述3種方法更為方便，在同一皿中即可實現多次重復，但其局限性是僅適用于短時間內就表現出抑制效果的生防菌。可將培養好的生防菌(或病原菌)菌餅接種于培養基中央，采用十字交叉法在以生防菌(或病原菌)菌餅為中心的≥20 mm十字線上的4點處接種病原菌(或生防菌)，恒溫培養一定時間后測量菌落直徑，計算抑菌率。

五點法在生防細菌的活性測定中被廣泛應用。植物內生細菌以其占據有利的生態位、不易受環境條件影響、能夠很好地定植于植株的相應部位、可抵抗病原物入侵等獨有的優勢，成為植物病害生物防治的潛在資源菌。趙超等[12]、周國旺等[13]、王西祥等[14]采用菌餅五點法，研究了熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)等生防細菌對芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioiles)、芒果蒂腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)、馬鈴薯腐皮鐮刀病菌(Fusariumsolani)等致病真菌的抑菌活性，表明3種細菌均具有較強的抑制效果且抑菌譜廣泛；進一步研究發現，枯草芽孢桿菌可以成功定植于植物根際、體表或體內，與病原菌競爭植物周圍的營養，并分泌抗菌物質，如細菌素、細胞壁水解酶等酶類和活性蛋白質類等物質，以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵，從而達到生物防治的目的。

菌餅法雖然適用范圍廣，但要結合生防菌或病原菌的生長速率因素，選用適宜的具體方法進行抑菌試驗。對于生長速率不一致的2個或多個菌種，需要考慮生長速率與時間的關系，部分菌種需要延長接種時間，從而減小菌種自身生長速率對試驗結果產生的影響。若遇到這種情況，需先將生長較慢的菌種接入平板，讓其先生長一定時間，再接種生長較快的菌種，培養至所接種的菌餅均距離培養基平板邊緣5 mm左右時進行數據測量，但具體延長時間需依據所研究菌種的培養特性決定。不同菌餅法的特點和適用生防菌范圍比較如表1所示。

表1 菌餅法的特點和適用生防菌種類Tab.1 Features of fungus cake method and applicable biocontrol species

2.2 菌液法

菌液法是繼菌餅法之后的另一種常用的對峙培養方法，該方法利用的不是生防菌的菌餅，而是其發酵液，主要用于生防真菌、細菌和酵母菌等次生代謝物質的生防效果研究。根據菌液在培養基上的滴加方式，可將菌液法分為涂布法、混勻法和五點法，不同菌液法的特點和所適用的生防菌范圍如表2所示。

表2 菌液法的特點和適用生防菌種類Tab.2 Features of solution method and applicable biocontrol species

2.2.1 菌液涂布法(Solution coating method，SCM) 涂布法即在培養基上滴加一定量的生防菌菌液，用無菌涂布棒涂勻并晾干，再接種病原菌，恒溫無菌條件下培養，通過計算抑制率，從而明確生防菌活性物質的抑菌效果。張岳等[15]在研究生防淺白酵母菌(Cryptococcusalbicans)對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌(Penicilliumdigitatum)的抑菌效果時采用了涂布的方法，結果表明，淺白酵母菌的抑菌活性好，抑制率高達83.1%和82.8%。

2.2.2 菌液混勻法(Solution blending method，SBM) 該方法是先將菌液與培養基按一定濃度及一定比例混勻，以不加菌液為對照，接種病原菌培養一段時間后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率。此方法操作簡捷，效果良好，被學者們廣泛應用于細菌、真菌等生防菌活性物質的篩選研究中。為了明確枯草芽孢桿菌EBS05菌株對12種農作物致病菌的抑菌活性，李剛等[16]首先利用酸沉淀法提取了該菌株的脂肽類抗生素，之后采用混勻法測定了抗生素對菌絲生長速率的抑制作用，其中，對小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)的作用效果最佳，抑菌中質量濃度(EC50)為0.012 mg/mL。甘林等[17]通過振蕩培養并經細菌過濾膜過濾得到木霉菌株FJ2006-8發酵液，采用混勻法研究了其對番茄灰霉病菌的抑菌效果，并分析出主要活性物質為聚酮類、氨基酸及其衍生物、萜烯類等。

2.2.3 菌液五點法(Five-spot solution method，FSM) 菌液五點法類似于菌餅五點法，即于中央放置病原菌菌餅，四周4點滴加供試生防菌菌液。一般情況下，首先制備生防菌菌液，并將其按一定量(如4 μL)滴加于培養基周圍選定的4點處，在培養基中央位置接種病原菌，根據有無抑菌圈及抑菌帶的寬度，判斷供試生防菌的拮抗效果。萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)和枯草芽孢桿菌次生代謝物質對番茄早疫病菌(Alternariasolani)的抑制效果試驗便是采用了菌液五點法，研究發現，2種細菌的次生代謝物質均可以抑制番茄早疫病菌菌絲的生長，導致其菌絲明顯畸形，從而發揮生防效果[18]。

真菌、細菌、酵母菌均可采用菌液法進行生防效果測定，其中，混勻法與涂布法最為常用。混勻法是將菌液直接混合于培養基中，因此菌液分布均勻，病原菌生長均勻，抑菌效果準確，但要求混合前培養液溫度不能太高，以免破壞菌液的生防活性；而涂布法是將菌液涂于培養基表面，使病原菌與菌液直接接觸，最大程度地發揮抑菌活性，但該方法操作時需要借助涂布器，往往會出現菌液涂布不均勻現象，從而導致病原菌菌落長勢不均，同時，由于菌液的濃度和顏色不同，可能會影響病原菌長勢的觀察和測量。

2.3 劃線法

劃線法常用于個體十分微小的細菌或放線菌等菌種，該菌種既可是生防供試菌或病原對象菌中的1種，也可同時作為兩者中的2種。根據生防菌與病原菌的生長速率差異，將劃線法具體分為即時劃線法和延時劃線法。

2.3.1 即時劃線法(Simultaneously lining method，SLM) 即時劃線法是于培養基一側接種病原菌，距其30 mm處接種供試生防菌，培養一段時間后，根據抑菌帶寬度判斷生防菌的抑菌效果。王雪潔等[19]采用即時劃線法研究了葡萄內生細菌銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)對10種植物致病菌的抑菌活性，結果表明，其對辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、番茄灰霉病菌的抑菌帶寬度分別為17.13、15.60 mm，對其他幾種病原菌的抑菌帶寬度也均≥5 mm，表明該菌具有很高的開發價值。血紅柳釘菇(Gomphidiusviscidus)對土傳病原菌有較強的抑菌活性，可將根癌菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌絲完全覆蓋并殺死，該研究結果獲得所采用的試驗方法為即時劃線法[20]。

2.3.2 延時劃線法(Delay marking method，DMM) 放線菌是一類廣泛分布于自然界、能產生多種抗生物質的拮抗微生物，在放線菌的抑菌活性研究中普遍采用延時劃線法。該方法是在即時劃線法的基礎上發展而來的，當生防供試菌或病原對象菌生長速度較慢時均可采用延時法：首先將生長較慢的一方接種于培養基表面一側，待生長至一定大小時，在另一側劃線接種生長較快的另一方，培養一定時間后測量抑菌帶寬度。徐斌等[21]采用此法研究了拮抗放線菌K13的抑菌活性和作用范圍，明確了K13的抑制效果和抑菌譜，并通過進一步的顯微觀察，明確了其作用方式，即引起病原菌菌絲扭曲、畸形、斷裂甚至解離，表明放線菌K13具有開發為生防菌劑的潛能。

2.4 擴散法

對峙培養中若需借助牛津杯、濾紙、打孔器等試驗工具或試驗手段才能完成的方法，則統稱為擴散法，主要用于研究生防菌次生代謝產物對病原菌的抑制效果。

2.4.1 牛津杯法(Oxford cup method，OCM) 牛津杯為直徑6 mm、高度10 mm的小鋼管，是用于抑菌試驗或藥敏試驗的一種輔助工具。試驗時主要將其放置于培養基中心，在其兩側或四周的對稱位置接種病原菌，也可將病原菌置于中心，而四周放置牛津杯，杯內加入供試生防菌(真菌或細菌)發酵液，根據抑菌圈直徑判斷生防效果。枯草芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)對葡萄灰霉病菌、蘋果褐腐病菌(Moniliniafructigena)等多種致病菌的抑制效果試驗借助了牛津杯進行，明確了2種生防細菌的抑菌活性和抑菌范圍；進一步顯微觀察發現，死谷芽孢桿菌對葡萄灰霉病菌的菌絲和分生孢子均具有致畸作用，導致菌絲不能正常生長以及分生孢子異常萌發或不萌發，從而發揮其生防作用[22-23]。

2.4.2 濾紙片法(Filtering paper method，FPM) 該法借助了濾紙片，適用于生防真菌和細菌活性物質的篩選，首先需要制作含發酵液的濾紙片，即將Whatman 3號濾紙或其他較厚定性濾紙打制成直徑相同的圓片，經濕熱滅菌及紫外燈下自然晾干后，在其上滴加定量發酵液或將其在發酵液中沾濕。吳衛剛等[24]采用濾紙片法研究了枯草芽孢桿菌對煙草疫霉菌(P.nicotianae)的抑菌活性，先將疫霉菌菌餅接種到培養基中央，再將4片濾紙片成對角線貼在距邊緣20 mm處的培養基上，其中3片分別滴加5 μL菌液，1片滴加等量無菌水作為對照，培養5 d后的抑菌帶寬度為14.7 mm，說明枯草芽孢桿菌對煙草疫霉菌具有較好的生防效果。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)對人參根腐病菌(腐皮鐮刀菌)的生防效果研究也采用了此方法，結果表明，解淀粉芽孢桿菌具有極顯著的抑菌效果，抑菌帶寬度達到了46.5 mm，說明該細菌是通過分泌某種抑菌活性物質發揮抑菌作用的[25]。此種方法下，也可將沾有菌液的濾紙片放于中央，四周放置不同種類的病原菌，可按試驗需求進行自由組合。

2.4.3 打孔法(Punch stiletto method，PSM) 打孔法是在固體培養基中借助打孔的方式注入發酵液，可以一孔也可多孔，將病原菌接種于平板一端或中央，于另一端或距離中心相同位置的兩端/四周用打孔器均勻打孔，加入定量供試生防菌發酵液，培養并觀察結果；供試生防菌和病原菌的位置也可調換。盧行等[26]在測定短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)X23對大腸桿菌(Escherichiacoli)的抑菌活性時采用此方法，抑菌帶寬度為20 mm，抑菌效果顯著。打孔法不僅可用于生防細菌對病原細菌的抑菌效果研究，也可用于生防真菌對病原真菌的活性測定。ZJ353菌株是一株來源于海洋沉積物樣品中的真菌，蔡思琦等[27]利用打孔法測定了其對8種病原真菌的抑菌效果，其中，對尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的抑菌帶寬度高達37.1 mm，作用效果顯著，但其分類地位有待于確定。

2.4.4 接種環法(Inoculating loop method，ILM) 枯草芽孢桿菌是一種抑菌活性顯著的生防細菌，李鐵軍等[28]采用接種環法研究了其對水稻紋枯病菌(R.solani)、番茄灰霉病菌的生防效果，抑菌率分別為29.4%、27.8%。該方法即在平板培養基中央(或四周)接種病原真菌，在其周圍四角(或中央)用接種環將生防細菌菌株或發酵液涂成直徑相同的圓形，培養數天后，觀察確定供試生防菌的抑菌活性。

4種擴散法均可1次測定2個及以上生防菌(或病原菌)，減少了重復，節約了時間與成本，并且借助試驗工具可有效防止不同菌種間的相互影響，進而提高試驗準確度。在不同的試驗需求下，可將病原菌與供試菌的放置位置自由組合，更好地完成試驗。這幾種擴散法的特點和所適用的生防菌范圍如表3所示。

表3 擴散法的特點和適用生防菌種類Tab.3 Features of diffusion method and applicable biocontrol species

3 展望

通過總結生防菌抑制效果研究中不同對峙培養方法的具體應用，可以指導試驗人員根據研究目的、生防菌種類、靶標材料和試驗內容等選擇合適的對峙方法，使試驗目的更加明晰、操作步驟更加簡捷、試驗結果更加科學。對峙試驗不僅可以明確生防菌的抑菌效果和抑菌譜，還可了解其抑菌方式，為深入研究生防菌的抑菌機制和將其開發成微生物農藥奠定了堅實的理論基礎，對峙試驗也可用于植物源農藥的相關研究。目前，對于生防菌的抑菌活性、作用方式、抑菌機制等的研究比較普遍，但能夠將其實際應用于田間的成品寥寥無幾[29-32]，生防菌的商品化是研究重點之一。同時，部分生防菌劑在實際應用中表現出一些問題，如生防效果不穩定、在作物上的定植能力低、效果受環境因素影響大，等等。針對這些問題，必須優化室內拮抗試驗過程，積極尋找或創造新的對峙試驗方法，從而篩選出穩定性強、效果突出、定植能力高的生防菌和活性物質，建立優化的發酵、增殖生產工藝和規范的生產質量標準，進而研發出高效安全廣譜的微生物農藥；并進一步加強微生物農藥作用機制研究，根據其作用位點和活性中心反推導，指導菌種選育，更新劑型，合成新農藥的先導化合物，創制新農藥，促進微生物農藥的產業化，保證無公害農產品的生產，保障食物安全，保護環境，促進農業可持續發展。