和厚樸酚對大鼠脊髓背根神經元細胞瞬時受體電位通道活化和小鼠模型瘙癢的影響

謝波 王永芳 宋莎莎 吳建兵 李新宇

1中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院藥物研究室，南京 210042；2中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院皮膚科，南京 210042

瘙癢是多種疾病伴有的共同癥狀［1-2］。目前，關于瘙癢的確切機制尚未完全清楚。研究顯示，神經細胞中瞬時受體電位通道A1（TRPA1）、V1（TRPV1）和瘙癢關系緊密，其開放引起Ca2+細胞內流，繼而引發瘙癢動作電位信號在神經纖維上傳導［3］。TRPV1主要介導組胺性瘙癢，而TRPA1主要介導非組胺性瘙癢［4］，且后者和許多炎癥介質釋放有關。臨床上急性瘙癢的治療主要用抗組胺藥等，而慢性瘙癢迄今尚無標準或普遍有效的方法［5］。一些中藥方劑有改善瘙癢的作用，厚樸是其中的一種組分［6］。厚樸中的酚類物質是其主要活性成分之一，和厚樸酚可抑制心肌細胞Ca2+內流［7］，并抑制IgE 復合物引起的過敏反應和減少化合物48/80 誘導的小鼠搔抓次數［8］。但和厚樸酚是否影響神經細胞瞬時受體電位通道（TRP）的活化尚無報道。本研究通過兩種小鼠瘙癢模型觀察和厚樸酚的止癢作用，觀察和厚樸酚對TRPV1 和TRPA1 激動劑誘導的大鼠脊髓背根神經元（DRG）細胞中Ca2+內流的影響，初步探討和厚樸酚的止癢作用機制。

材料與方法

一、材料

1.動物：4 ～ 6 周齡清潔級雄性ICR 小鼠，體重25 ～35 g，來自揚州大學比較醫學中心，生產許可證號為SCXK 蘇2017-0007，實驗動物質量合格證號201821683。給予標準飼料、飲水，飼養環境溫度22 ～ 24 ℃，濕度55% ～ 60%，光照12 h白/黑夜循環，動物實驗許可證號SYXK（蘇2017-007）。24 h內新生的SPF級雄性SD大鼠來自南京青龍山動物育種場，生產許可證號SCXK 蘇2017-0001，實驗動物質量合格證號201828729，于環境溫度22 ～24 ℃下即刻進行后續的DRG分離。

2.主要試劑和儀器：和厚樸酚、氯苯那敏和組胺均為分析標準品，純度≥98%，均產自南京森貝伽生物科技公司。辣椒素（分析標準品，純度≥98%）產自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣椒平（分析標準品，純度 ≥98%）產自加拿大Toronto Research Chemicals 公司。胎牛血清、Neurobasal 培養基、Ⅰ型膠原酶、B27 均產自美國Gibco 公司；L-谷氨酰胺產自北京索萊寶科技有限公司；膠質細胞源性神經營養因子產自美國PeproTech 公司；阿糖胞苷產自上海生工生物工程股份有限公司；異硫氰酸烯丙酯（AITC）、HC030031（TRPA1拮抗劑）、Fluo-3-AM（Ca2+熒光指示劑）產自美國Sigma-Aldrich 公司；Pluronic F-127（非離子型表面活性劑）、含Ca2+的HBSS產自上海碧云天生物技術有限公司；二氧化碳細胞培養箱來自美國Thermo Fisher Scientific公司。

二、方法

本研究中所有動物實驗均遵循中國醫學科學院皮膚病醫院實驗動物管理委員會相關指南執行。正式實驗前首先對和厚樸酚的安全劑量進行測試，確定將50 mg/kg（最大安全劑量）作為以下動物實驗的最大給藥劑量。

1.組胺誘導的小鼠瘙癢模型實驗：45 只ICR小鼠隨機分成7 組，包括正常對照組3 只，模型組、氯苯那敏組、3 種劑量和厚樸酚組（50.0、25.0、12.5 mg/kg，用5 g/L羧甲基纖維素鈉配制）和溶媒組每組7只。小鼠頸背部剃毛（2 cm×2 cm）后，和厚樸酚組用不同濃度和厚樸酚灌胃，正常對照組和模型組給予等量生理氯化鈉溶液灌胃，溶媒組給予5 g/L羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，氯苯那敏組給予氯苯那敏5.0 mg/kg（用無菌生理氯化鈉溶液配制）灌胃。24 h后，正常對照組在頸部剃毛區皮內注射100 μl生理氯化鈉溶液，其余各組注射100 μl（20 mmol/L）組胺。隨后將每只小鼠單獨置于觀察籠中，人工計數30 min內小鼠后爪搔抓注射部位的次數［9］。

2.乙醚/丙酮/水（AEW）誘導的小鼠瘙癢模型實驗：28 只ICR 小鼠隨機分成6 組，其中正常對照組3 只，模型組、3 個劑量和厚樸酚組（50.0、25.0、12.5 mg/kg，用5 g/L 羧甲基纖維素鈉配制）和溶媒組每組5 只。所有小鼠頸背部剃毛；模型組、和厚樸酚組和溶媒組用乙醚∶丙酮（1∶1）擦拭剃毛區15 s后，用蒸餾水擦拭30 s，正常對照組用生理氯化鈉溶液擦拭，每天處理2 次，第5 天僅上午處理1 次，并在第4天時灌胃給藥，和厚樸酚組用不同濃度和厚樸酚灌胃，正常對照組給等量無菌生理氯化鈉溶液灌胃，溶媒組給予5 g/L 羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。24 h后將每只小鼠單獨置于觀察籠中，觀察并人工計數小鼠后爪30 min內搔抓造模區的次數［10］。

3.DRG細胞分離培養和Ca2+成像實驗：摘取新生SD 大鼠脊髓背根神經節，用0.25%Ⅰ型膠原酶消化后按5×104/ml 接種至含有Neurobasal 培養基（含10%胎牛血清）的35 mm 玻璃底培養皿中，37 ℃、5%CO2環境下培養24 h，待細胞貼壁后更換成含2%胎牛血清、2%B27、0.1 g/L L-谷氨酰胺、10 μg/L 膠質細胞源性神經營養因子和5 μmol/L 阿糖胞苷的Neurobasal培養基，繼續培養5 d［11］。將培養所得的DRG 細胞分成6 組：辣椒素或AITC 誘導的模型組、辣椒平［500 μmol/L，采用二甲基亞砜（DMSO）溶解并用Hanks 平衡鹽溶液（HBSS）稀釋］或HSC030031（10 μmol/L）組、溶媒組、3 種濃度和厚樸酚組（7.81、15.63、31.25 mg/L，用DMSO溶解并用培養基稀釋）。各組細胞棄培養基，用HBSS洗滌2次。加300 μl Ca2+熒光指示劑Fluo-3-AM/Pluronic F-127，5%CO2、37 ℃下孵育30 min后，模型組加入65 μl HBSS，辣椒平、HC030031以及各和厚樸酚組則用HBSS將藥液稀釋至設定終濃度后各加65 μl，溶酶組用5‰DMSO 溶液同法處理，激光掃描共聚焦顯微鏡下確定視野，每15 秒拍攝1 張圖片，連續拍攝20張，且在第1和第2張圖片的拍攝間隙將65 μl 辣椒素（1 000 μmol/L，DMSO 溶解并用 HBSS 稀釋）或AITC（200 μmol/L，DMSO 溶解并用HBSS 稀釋）加至平皿中［12］。統計每張照片的相對熒光強度（F），做相對熒光強度-時間曲線，計算相對熒光強度變化率（△F/F0），ΔF=Fmax-F0［12］，Fmax為熒光強度最大值，F0為熒光強度初始值。

4.統計學處理：用SPSS 20.0 軟件進行分析。搔抓次數結果以表示，通過單因素方差分析和Dunnet-t檢驗進行比較，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

結 果

一、和厚樸酚對組胺和AEW誘導的小鼠瘙癢模型搔抓次數的影響

在組胺瘙癢模型中，各組間搔抓次數差異有統計學意義（F=40.62，P＜ 0.001），見圖1A。與正常對照組比較，組胺模型組的搔抓次數顯著增多（t=3.59，P=0.004）。與組胺模型組相比較，50.0 mg/kg和25.0 mg/kg 和厚樸酚組的搔抓次數均明顯減少（t值分別為3.48、3.49，P值均為0.003），對瘙癢的抑制率分別為61.82%和60.65%；5.0 mg/kg 氯苯那敏組亦明顯減少（t=2.68，P=0.016），而組胺模型組與12.5 mg/kg 和厚樸酚組（t=2.01，P=0.062）和溶媒組（t=0.34，P=0.737）相比，差異均無統計學意義。

圖1 不同劑量和厚樸酚對組胺（1A）和乙醚/丙酮/水（1B）誘導的小鼠瘙癢模型搔抓次數的影響 NC：正常對照組；MC：模型組；SC：溶媒組；CH：氯苯那敏組；Hon1 ～ Hon3：分別為和厚樸酚50.0、25.0、12.5 mg/kg組。a：P＜0.01；b：P＜0.05

在AEW 瘙癢模型中，各組間搔抓次數差異亦有統計學意義（F=11.12，P＜0.001）。見圖1B。與正常對照組比較，AEW 模型組的搔抓次數顯著增多（t=6.99，P＜ 0.001）。與AEW模型組比較，50 mg/kg和厚樸酚組搔抓次數顯著減少（t= 0.45，P=0.009），對瘙癢的抑制率為42.89%；AEW 模型組與25.0 和12.5 mg/kg 和厚樸酚組（t=1.00，P=0.343；t=0.24，P=0.813）以及溶媒組（t=0.45，P=0.665）相比，差異均無統計學意義。

二、和厚樸酚對辣椒素誘導的DRG細胞TRPV1通道開放后Ca2+內流的影響

大鼠DRG 細胞原代分離、培養后，在Ca2+熒光指示劑Fluo-3-AM/Pluronic F-127處理下，用辣椒素激活TRPV1通道后，各組熒光強度見圖2、3。模型組在加入辣椒素30 ～45 s 后即出現相對熒光強度峰值，△F/F0超過1。隨著時間延長（約60 s后），熒光強度緩慢減弱，165 s后迅速減弱，300 s時接近原始水平。45 s時模型組細胞熒光亮度明顯高于15 s。用15.63、31.25 mg/L和厚樸酚處理后均未檢測到任何熒光強度峰。7.81 mg/L 和厚樸酚處理后，辣椒素誘導約45 s時雖然出現相對熒光強度峰，但比模型組大約減弱一半。溶媒組在約45 s 時出現的峰值略低于模型組。辣椒平組Ca2+內流明顯抑制，未見熒光強度峰值。

圖2 不同濃度和厚樸酚處理對辣椒素誘導的大鼠脊髓背根神經元細胞瞬時受體電位通道V1 通道開放后Ca2+內流的影響 ΔF/F0：相對熒光強度變化率，其值越大表明與初始值相比相對熒光強度升高越多

圖3 不同處理組大鼠脊髓背根神經元細胞在辣椒素誘導后不同時間點的熒光強度

三、和厚樸酚對AITC誘導的DRG細胞TRPA1通道開放后Ca2+內流的影響

見圖4、5。模型組在加入AITC 30 ～ 45 s 后即出現相對熒光強度峰值，△F/F0超過0.5；約60 s后，熒光強度緩慢減弱，300 s時接近原始值；45 s時細胞熒光亮度明顯高于15 s時。31.25 mg/L和厚樸酚組未檢測到任何熒光強度峰，15.63 和7.81 mg/L和厚樸酚組在AITC誘導約45 s時雖然出現相對熒光強度峰值，但比模型組大約減弱2/3和1/3。給予TRPA1 抑制劑HC030031 處理后未見熒光強度峰值。

討 論

目前對慢性瘙癢的治療效果常不理想［13］，TRPV1 和 TRPA1 是介導瘙癢的兩種受體通道［14］，其開放后Ca2+的細胞內流與瘙癢動作電位在神經纖維上的傳導、釋放瘙癢信號相關。

圖4 不同濃度和厚樸酚處理對異硫氰酸烯丙酯誘導的大鼠脊髓背根神經細胞瞬時受體電位通道A1通道開放后Ca2+內流的影響 ΔF/F0：相對熒光強度變化率，其值越大表明與初始值相比相對熒光強度升高越多

圖5 不同處理組大鼠脊髓背根神經元細胞在異硫氰酸烯丙酯誘導后不同時間點的熒光強度

中藥厚樸來源于木蘭科植物厚樸的干皮、根皮及枝皮，和厚樸酚是厚樸的活性成分之一。我們在組胺誘導的小鼠瘙癢模型中觀察到和厚樸酚具有抑制瘙癢的作用（50 mg/kg 劑量下抑制率為61.82%）；在建立的大鼠原代DRG細胞TRPV1通道活化模型中，通過Ca2+成像實驗發現和厚樸酚能明顯抑制TRPV1 受體激動劑辣椒素誘導的Ca2+細胞內流，提示其阻斷組胺性瘙癢可能與對TRPV1 通道的作用有關。AEW瘙癢模型可被用作觀察非組胺性刺激誘導的瘙癢［10］。本研究中和厚樸酚對AEW瘙癢模型亦有一定的抑制作用（50 mg/kg劑量時抑制率為42.89%），同時對TRPA1 受體激動劑AITC誘導的Ca2+細胞內流亦有明顯抑制，提示和厚樸酚對抗非組胺性瘙癢的作用可能與TRPA1通道活化受阻有關。

總之，本研究結果表明，和厚樸酚對組胺因素和非組胺因素引起的瘙癢均有抑制作用，同時能抑制大鼠DRG細胞TRPV1和TRPA1通道活化后Ca2+細胞內流，提示可能影響后續的瘙癢信號傳導。以上結果提示，和厚樸酚在對抗瘙癢方面具有一定的潛在價值，其對TRP通道分子靶點的作用以及更多的組織學聯系值得進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突