二甲雙胍對銀屑病樣小鼠模型皮損炎癥狀態及磷酸化Stat3蛋白表達的影響

蘇蓓蓓 甘泉 甘才斌

新鄉市中心醫院皮膚科，河南 453000

銀屑病是由免疫、遺傳及環境等多種因素介導的慢性炎癥性皮膚病，具體發病機制不清［1］。信號轉導和轉錄激活因子3（Stat3）是JAK/Stat信號轉導途徑中最為關鍵的核轉錄因子之一，在細胞增殖、凋亡、分化和血管生成、免疫調節及癌癥等方面具有重要的生物學作用［2］。既往研究認為，JAK/Stat3信號轉導可通過影響角質形成細胞增殖及凋亡、機體炎癥因子的表達等在銀屑病發病機制中具有關鍵性作用［3-4］。二甲雙胍是一種臨床上廣泛應用于2 型糖尿病的降糖藥，對皮膚科諸多疾病如銀屑病、痤瘡等也具有一定作用［5］。研究顯示［6-7］，二甲雙胍可通過下調JAK/Stat3信號轉導抑制食管鱗狀上皮和胰腺腫瘤細胞的生長。二甲雙胍對于銀屑病的潛在療效是否可能通過減少Stat3磷酸化實現尚不清楚。我們通過構建咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損模型，觀察二甲雙胍對小鼠銀屑病樣皮損的嚴重程度、血清炎癥因子及皮損組織中白細胞介素17（IL-17）和p-Stat3表達水平的影響。

材料與方法

一、材料

6 ～8周齡雄性健康SPF級Balb/c小鼠，體重17～24 g，產自河南新鄉華蘭生物實驗動物中心［實驗動物合格證號：201801140035，動物生產許可證號：SCXK（豫）2015-0001］，小鼠在室溫 23 ℃ ±1 ℃、明/暗各12 h的條件下飼養，自由取食（高壓蒸汽滅菌用水及正常飼料喂養），動物實驗許可證號SCXK（豫）2017-002。二甲雙胍粉劑（美國Sigma公司）純度≥97%，用pH6.8 的磷酸鹽緩沖液在超聲振蕩下溶解。咪喹莫特乳膏（規格：3 g∶0.15 g，湖北科益藥業股份有限公司）。一抗為兔抗鼠IL-17及p-Stat3 單克隆抗體（英國Abcam 公司），二抗即辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG單克隆抗體（上海碧云天生物技術有限公司）。小鼠IL-17 和腫瘤壞死因子α（TNF-α）Quantikine ELISA 試劑盒（美國R&D 公司），鼠IL-6 Quantikine ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）。

二、方法

1.動物分組和藥物干預處理：將50只Balb/c雄性小鼠隨機分為對照組、咪喹莫特組、3 個咪喹莫特聯合二甲雙胍組（IM-Met組中二甲雙胍濃度分別為 100、150 和 200 g/L），每組 10 只。5 組小鼠體重差異無統計學意義（F=0.98，P＞ 0.05）。小鼠背部使用脫毛膏脫毛，對照組局部外用凡士林乳膏且腹腔注射生理氯化鈉溶液0.3 ml，咪喹莫特組局部外用咪喹莫特［8］且腹腔注射生理氯化鈉溶液0.3 ml，3 個IM-Met 組局部外用咪喹莫特，腹腔分別注射100、150 和 200 g/L 二甲雙胍溶液 0.3 ml。于每天9：00 涂藥和腹腔注射，以首次干預作為第1 天，連續7 d，每日記錄小鼠銀屑病樣皮損的面積與嚴重度指數（PASI）積分，7 d 后處死所有小鼠。預實驗結果表明，用二甲雙胍干預IM-Met 組7 d后，對照組、咪喹莫特組和100、150、200 g/L IM-Met組小鼠隨機血糖值分別為10.45、9.63、11.87、9.32、10.73 mmol/L，5 組間隨機血糖值差異無統計學意義（F=1.28，P＞0.05）；晚8點小鼠禁食后于清晨7 點測5 組小鼠空腹血糖值分別為5.87、4.63、6.14、5.55、6.02 mmol/L，各組間差異無統計學意義（F=1.57，P＞0.05）。

2.Western 印跡檢測皮損 IL-17 和 p-Stat3 的表達：取5 組小鼠背部皮膚置于研缽中，加入液氮并研磨成粉末后移入1.5 ml EP 管，加入500 μl RIPA裂解液（含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑），冰上孵育約30 min，4 ℃下12 000 r/min（離心半徑4 cm）離心20 min，吸取上清液于-80 ℃冰箱中保存。取5 μl 蛋白樣品進行凝膠電泳，電轉液中電轉，牛奶封閉，加入一抗IL-17 抗體（1∶1 000）、p-Stat3 抗體（1∶1 000）、β 肌動蛋白抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入二抗（1∶1 000）孵育1 h，采用化學發光法檢測目的條帶的灰度值，以目的蛋白與β 肌動蛋白灰度值比值表示蛋白表達水平。所有實驗重復3次。

3.血清IL-17、IL-6和TNF-α水平測定：處死小鼠時取眶周血5 ml于抗凝管中，在常溫下離心收集上層血清-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA法檢測小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α的表達水平，具體步驟參考試劑盒說明書。每只小鼠測定時均設置3 個復孔，取3次檢測的平均值。

三、統計學處理

結 果

一、二甲雙胍對小鼠銀屑病樣皮損形態學和組織學的影響

7 d后，對照組小鼠背部皮膚未出現明顯變化，而咪喹莫特組小鼠背部出現大面積紅斑和鱗屑。100、150 和 200 g/L IM-Met 組小鼠背部紅斑面積和鱗屑相對于咪喹莫特組顯著減輕，見圖1。150 g/L IM-Met 組紅斑和鱗屑嚴重程度顯著低于100 g/L IM-Met組，但同200 g/L IM-Met組比較無明顯區別。

圖1 第7天肉眼觀察5組小鼠背部皮膚狀況 對照組小鼠背部皮膚光滑；咪喹莫特（IM）組小鼠背部出現紅斑和大量厚層鱗屑；3個IM-二甲雙胍（IM-Met）組小鼠背部均出現紅斑和厚層鱗屑，但程度輕于IM組小鼠；150 g/L IM-Met組和200 g/L IM-Met組紅斑面積和鱗屑厚度相近，但均少于100 g/L IM-Met組

圖2 5組小鼠背部皮損的組織學改變（HE×100） 對照組小鼠背部皮膚表皮及真皮層結構無異常；咪喹莫特（IM）組表皮增厚，表皮突延長，伴有角化不全及微膿腫；3個IM-二甲雙胍（Met）組表皮稍增厚，伴有角化不全及微膿腫

組織病理檢查（HE染色）結果（圖2）顯示，與對照組比較，咪喹莫特組表皮明顯增厚，表皮突延伸伴有角化不全及微膿腫；而IM-Met 組表皮增厚程度輕于咪喹莫特組；150 g/L IM-Met 組表皮增厚程度輕于100 g/L IM-Met組，但同200 g/L IM-Met組相比變化不明顯。

二、二甲雙胍對小鼠PASI積分的影響

5 組小鼠 PASI 積分第 1 ～ 7 天變化見圖 3。第1 ～3天咪喹莫特組及IM-Met組4組小鼠間PASI積分無顯著差異。第4 ～7 天，咪喹莫特組PASI 積分顯著高于IM-Met 組小鼠，差異均有統計學意義（F值分別為 9.45、12.82、19.66 和 22.47，均P＜0.05）。第 4 天開始 100 g/L IM-Met 組 PASI 積分顯著高于150 g/L IM-Met組和200 g/L IM-Met組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而150 g/L IM-Met組和200 g/L IM-Met 組第1 ～7 天差異均無統計學意義（t值分別為 1.34、0.98、1.10、1.18、0.35、0.33 和0.29，均P＞0.05）。

三、二甲雙胍對小鼠銀屑病樣皮損中IL-17和p-Stat3蛋白表達水平的影響

圖3 5組小鼠皮損銀屑病皮損面積與嚴重度指數（PASI）積分變化 IM，咪喹莫特；Met，二甲雙胍

見圖4 和表1。Western 印跡檢測顯示，5 組小鼠背部皮損IL-17和p-Stat3蛋白表達水平差異有統計學意義（均P＜0.05）。咪喹莫特組IL-17和p-Stat3蛋白表達水平同對照組相比顯著升高（均P＜0.01）；150 g/L200 g/L IM-Met 組 IL-17 和 p-Stat3 蛋白表達水平差異無統計學意義（均P＞0.05），但均低于100 g/L IM-Met 組（均P＜0.05）和咪喹莫特組小鼠（均P＜0.05）；100 g/L IM-Met組小鼠背部皮損區IL-17和p-Stat3蛋白表達同咪喹莫特組相比顯著降低（均P＜0.05）。

四、二甲雙胍對小鼠血清IL-17、IL-6 和TNF-α表達水平的影響

5組小鼠血清炎癥因子IL-17、IL-6和TNF-α水平差異均有統計學意義（F值分別為15.69、36.78和20.41，均P＜0.05），對照組3 種炎癥因子水平均顯著低于其余4 組，而咪喹莫特組均顯著高于其余4 組（均P＜0.05）。3 個IM-Met 組血清炎癥因子表達水平兩兩比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），200、150 和 100 g/L IM-Met 組 IL-17、IL-6 和TNF-α水平依次升高。見表2。

討 論

多項研究表明，JAK/Stat3 信號轉導通路在銀屑病發病機制中具有重要作用［3-4，9-10］。Sano 等［9］發現，K5.Stat3c轉基因小鼠皮膚角質形成細胞中過度表達活化的Stat3，出生2周后小鼠皮膚開始出現斑塊和鱗屑，組織病理和銀屑病病理特點相一致，使用寡聚核苷酸抑制Stat3 蛋白表達可顯著減少K5.Stat3c 小鼠銀屑病樣皮損形成。冉立偉等［10］通過免疫組化檢測21例銀屑病患者皮損和20例正常皮膚Stat3 和p-Stat3 表達水平，發現銀屑病患者皮損Stat3 和 p-Stat3 表達水平顯著升高，且與 PASI 呈正相關。

圖4 5 組小鼠背部皮膚組織中白細胞介素17 和p-Stat3 蛋白的表達情況 1：對照組；2：咪喹莫特（IM）組；3：100 g/L IM-二甲雙胍（Met）組；4：150 g/L IM-Met組；5：200 g/L IM-Met組

表1 銀屑病樣小鼠背部皮膚組織中白細胞介素17（IL-17）和p-Stat3蛋白相對表達水平

表2 銀屑病樣小鼠血清炎癥因子水平比較（ng/L，）

表2 銀屑病樣小鼠血清炎癥因子水平比較（ng/L，）

注：n=10。IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IM：咪喹莫特；Met：二甲雙胍。a 與對照組比較，P＜0.05；b 與咪喹莫特組比較，P＜0.05；c 與200 g/L IMMet組比較，P＜0.05；d 與150 g/L IM-Met組比較，P＜0.05

組別對照組咪喹莫特組IM-100 g/L Met組IM-150 g/L Met組IM-200 g/L Met組F值P值IL-17 15.882±1.793 49.567±5.697a 44.008±1.722a b c d 33.388±1.556a b c 26.720±2.156a b 15.69＜0.05 IL-6 96.294±3.195 281.014±12.881a 260.926±7.724a b c d 210.741±4.440a b c 174.997±9.501a b 36.78＜0.05 TNF-α 128.779±3.266 291.117±3.245a 271.409±3.037a b c d 249.434±8.594a b c 193.034±6.661a b 20.41＜0.05

二甲雙胍作為一種常用的降糖藥在臨床上使用多年，但其對皮膚科疾病如銀屑病也具有潛在的治療效果。2008 年一項包含36 702 例初診為銀屑病患者的病例對照研究結果顯示，口服二甲雙胍能顯著降低銀屑病的發病風險［11］。Wu 等［12］調查9 243 例糖尿病患者發現，經常口服二甲雙胍可顯著降低銀屑病的發生風險。Singh 和 Bhansali［13］對38例銀屑病合并代謝綜合征患者開展的一項單中心隨機對照試驗結果顯示，試驗組患者口服二甲雙胍聯合甲氨蝶呤后紅斑、鱗屑及持續時間得分顯著低于單獨口服甲氨蝶呤患者。既往研究提示，二甲雙胍治療銀屑病的可能機制包括：上調人角質形成細胞內腺苷酸活化蛋白激酶和p-ERK1/2 水平，通過抑制P38 絲裂原激活的蛋白激酶信號轉導通路的激活或抑制mTOR 及其下游因子核糖體S6 蛋白激酶的蛋白表達來抑制人角質形成細胞的過度增殖［14-15］；抑制 Raf/EPK 信號轉導通路從而降低人角質形成細胞Nrf2的表達［16］，而Nrf2屬于調節角質形成細胞過度增殖的關鍵蛋白之一［17］。

本研究結果顯示，3個IM-Met組小鼠背部皮膚紅斑面積、鱗屑嚴重程度和PASI 積分、皮損中IL-17及p-Stat3蛋白表達水平和血清炎癥因子水平均顯著低于咪喹莫特組；200、150 g/L 二甲雙胍溶液對于小鼠皮膚紅斑面積和鱗屑嚴重程度的降低及PASI 積分的改變無顯著差異，且這兩組小鼠背部皮損區p-Stat3和IL-17蛋白水平也同樣無顯著差異，但均低于咪喹莫特組和100 g/L IM-Met組小鼠，提示二甲雙胍對于銀屑病的治療作用可能是通過減少Stat3的活化，同時治療作用呈非劑量依賴性。本實驗結果與二甲雙胍可減少Stat3活化的結論［6-7］相一致，但上述研究均未明確表明二甲雙胍如何抑制JAK/Stat3 信號轉導及具體的分子生物學相關機制。盧博等［18］采用不同濃度二甲雙胍作用于多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226 和U266 發現，二甲雙胍通過抑制Stat3 的磷酸化抑制RPMI8226和U266細胞的增殖并誘導其凋亡。我們對銀屑病小鼠模型血清炎癥因子的檢測發現，二甲雙胍濃度越高，小鼠血清炎癥因子水平越低，可能因為二甲雙胍干預后，血清炎癥因子的變化相對于皮損區蛋白水平的變化更加敏感，也可能與二甲雙胍本身可通過抑制蛋白激酶B 和細胞外信號調節激酶信號通路進而抑制NF-κB活化、降低機體炎癥因子釋放有關［19-20］，但這些推測需要更多的實驗加以證實。

以上結果表明，二甲雙胍顯著降低銀屑病小鼠模型機體的炎癥狀態可能是通過減少Stat3磷酸化所致。然而，本研究的局限性在于僅僅證明二甲雙胍能夠減少Stat3 的磷酸化，并未對調節Stat3 的上游信號如JAK或腺苷酸活化蛋白激酶等進行研究。盡管多項研究顯示，二甲雙胍能顯著抑制角質形成細胞過度增殖［21-22］，但這些研究的局限性在于僅僅探討了二甲雙胍對人角質形成細胞的影響，而非銀屑病患者或動物模型。我們首次探討二甲雙胍對銀屑病樣小鼠模型的作用及其相關機制，為該藥應用于銀屑病的治療提供了一定的理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝新鄉醫學院動物中心所有參與本實驗的老師、本科生及研究生