嗜熱脂肪芽孢桿菌液體發酵條件的優化

□ 陶文靖 胡素麗 北京美正生物科技有限公司

□ 趙婷婷 光明乳業股份有限公司華東中心工廠

□ 付敏 中農孚德檢測技術（北京）有限公司

1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的介紹

1.1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的特性

1917年Smith等在實驗室分離出嗜熱脂肪芽孢桿菌，1920年Donk將其歸類于芽孢桿菌屬（Bacillus）并以嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus） 來 命 名[1]。2001 年，Nazina等將包括嗜熱脂肪芽孢桿菌在內的6種菌株從芽孢桿菌屬分離出來，并歸類為芽孢桿菌屬（Geobacillus），目前該屬已經被國際所公認[2]。ATCC、DSMZ，以及國際權威標準和藥典等已經將嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）更名為嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）， 但中國依然習慣稱其為嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）。

嗜熱脂肪芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌，該菌營養細胞呈長桿、圓端狀，多數為單菌落，少數會成對或呈鏈狀排列[3]。嗜熱脂肪芽孢桿菌的最佳生長溫度為5 6～6 0℃，最高生長溫度為6 5～7 5℃，最低生長溫度為3 5～4 5℃。此外，該菌是需氧或兼性厭氧菌，消耗葡萄糖產酸不產氣，其最適p H值為 6.8～7.2，當 p H值接近 5時該菌就不能生長[4]。培養基的營養成分對芽孢生成率有明顯的影響——在培養基中加入無機離子可提高芽孢產率和芽孢熱抗力，如鈣離子濃度增加可使芽孢的熱抗力增強[1]。

1.2 嗜熱脂肪芽孢桿菌的應用

嗜熱脂肪芽孢桿菌可以作為生物指示劑，由于其產生的孢子具有非致病性、無熱原、無毒等特性，并且耐高溫和高壓，因此被歐洲藥典、美國藥典和日本藥典用作熱滅菌生物指示劑。我國也將該菌株列入《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》（GB 5981-1995）和《消毒技術規范》（2002版）[5]。此外，該菌還被廣泛應用于牛奶中抗生素的檢測[6]，乳品中抗生素試劑盒應用的檢測方法就是依據嗜熱脂肪芽胞桿菌生長、萌發產酸使培養基的顏色發生改變的原理，將其作為檢測指標。

2 儀器與材料

2.1 實驗儀器

超凈工作臺：江蘇蘇凈安泰有限公司；pH測試計：ALALIS安萊立思；恒溫搖床：上海一恒科學儀器有限公司；電子天平：梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；磁力攪拌器：IKA儀科；恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；顯微鏡：奧林巴斯（北京）銷售服務有限公司。

2.2 實驗材料和試劑

蛋白胨：北京陸橋技術有限責任公司；酵母粉：北京陸橋技術有限責任公司；NaCl、CaCl2等：北京陸橋技術有限責任公司；NaOH：國藥集團化學試劑有限公司。

3 實驗方法

3.1 菌株的活化培養

在無菌條件下用接種環取一環誘變后的HY嗜熱脂肪芽孢桿菌，接入含有50mL配有培養基的150mL三角瓶里，置于60℃、140rpm/min的條件下在水浴搖床培養18h，制備種子液。

3.2 芽孢鏡檢及產率計算

①玻片制備：取一片干凈的載玻片，于中央處滴加1滴無菌水，在超凈工作臺內用接種針取菌膜涂于水滴內并混勻。載玻片用酒精燈的外焰過火加熱直至菌膜干涸。

②染色：滴加7.6%的孔雀石綠染液于菌膜上，待看到染液上方發煙后開始計時，并不停補色，5min后用細水流沖洗玻片一端，然后用洗耳球吹干水分。滴沙黃復染液，染色5min，沖洗玻片后吹干。

③觀察：打開顯微鏡，用100倍油鏡觀察。在視野中可看到菌體被染成紅色，芽孢被染成綠色。觀察結束后，用蘸有乙醚酒精液的擦鏡紙擦拭鏡頭。

芽孢產率計算公式如下：

該式中，Z為芽孢產率；M1為芽孢數；M2為細菌數。

3.3 產孢培養基營養成分的優化

設定基礎培養基成分配比及產孢條件：0.5%蛋白胨、0.6%酵母粉、0.3%NaCl、pH7.0、接種量0.1%、裝液量100mL、培養時間24h、培養溫度60℃。通過單因素實驗對基礎培養基成分進行實驗優化，分別設置實驗條件因素如下：

①蛋白胨濃度分別為0.5%、0.8%、1.0 %、1.2%、1.5%、1.8%；

②酵母膏濃度分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%；

③NaCl濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；

④添加MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L；

⑤ 添 加 CaCl2濃 度 分 別 為 0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L；

⑥添加FeSO4·7H2O濃度分別為0、1、2.5、5、7.5、10mmol/L；

⑦pH分別選擇至6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4。

分別取100mL培養基裝入250mL的錐形瓶中，將活化后的嗜熱脂肪芽孢桿菌種子液以0.1%的接種量接種到培養基中，置于培養箱中，將溫度調至60℃培養24h，通過芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產率，以芽孢產率為指標，重復3次實驗，確定培養基中營養成分配比。

3.4 產孢培養條件的優化

以3.3中得到的最優培養基組分為基礎，進行發酵條件（溫度、時間、接種量）優化。通過單因素實驗對產孢條件進行實驗優化，分別設置實驗條件因素如下：

①培養溫度分別設置為55、60、65、70、75℃；

②培養時間分別設置為16、20、24、32、36、40h；

③接種量分別設置為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%。

通過芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產率，以芽孢產率為指標，重復3次實驗，確定最佳產孢條件。

3.5 優化后條件的驗證

對經過3.3和3.4實驗優化所得到的最優條件進行組合，進行5次芽孢發酵實驗，對芽孢產率進行驗證。

4 結果與分析

4.1 培養基營養成分的確定

4.1.1 蛋白胨濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以最初培養基組成比例為基礎，更改蛋白胨的含量分別為0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%，結果如圖1所示。

圖1 蛋白胨濃度對芽孢產率的影響

由圖1結果顯示，在一定范圍內，隨著蛋白胨濃度的加大，芽孢產率隨之升高。當蛋白胨濃度為0.8%時，芽孢產率達到最高，為37.1%；當蛋白胨濃度大于1.0%時，芽孢產率隨之呈現下降趨勢。所以，確定以0.8%蛋白胨濃度作為以下產孢培養基的成分。

4.1.2 酵母膏濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數為前提，更改酵母膏的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，結果如圖2所示。

由圖2結果顯示，在一定范圍內，伴隨酵母膏濃度的加大，芽孢產率隨之提高。當酵母膏濃度在0.3%時，芽孢產率達到最高，為34.2%；當酵母膏濃度大于0.3%時，芽孢產率隨之呈現下降趨勢。通過此實驗，確定以0.3%酵母膏濃度作為以下產孢培養基的成分。

圖2 酵母膏濃度對芽孢產率的影響

4.1.3 NaCl濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數為前提，更改NaCl的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，結果如圖3所示。

圖3 NaCl濃度對芽孢產率的影響

由圖3結果顯示，在一定范圍內，伴隨NaCl濃度的加大，芽孢產率隨之提高。當NaCl濃度在0.3%時，芽孢產率達到最高，為34.7%；當NaCl濃度大于0.3%時，芽孢產率隨之呈現下降趨勢。通過此實驗，確定以0.3%NaCl濃度作為以下產孢培養基的成分。

4.1.4 Mn2+濃度的確定

圖4 Mn2+對芽孢產率的影響

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數為前提，更改MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L，結果如圖4所示。

由圖4結果顯示，在一定范圍內，伴隨Mn2+濃度的加大，芽孢產率隨之提高。當Mn2+濃度為0.9mmol/L時，芽孢產率達到最高，為42.6%；當Mn2+濃度大于0.9mmol/L時，芽孢產率隨之呈現下降趨勢。因此，確定產孢培養基中Mn2+的添加量為0.9mmol/L。

4.1.5 Ca2+濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數為前提，增加 CaCl2分別為 0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L，結果如圖5所示。

圖5 Ca2+對芽孢產率的影響

由圖5結果顯示，在一定范圍內，伴隨Ca2+濃度的加大，芽孢產率隨之提高。當Ca2+濃度為10mmol/L時，芽孢產率達到最高，為47.2%；當Ca2+濃度大于10mmol/L時，芽孢產率隨之呈現下降趨勢。通過此實驗，確定產孢培養基中Ca2+的添加量為10mmol/L。

4.1.6 Fe2+濃度

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數為前提，增 加 FeSO4·7H2O 濃 度 分 別 為 0、1、2.5、5、7.5、10、12.5mmol/L，結果如圖6所示。

由圖6結果顯示，在一定范圍內，伴隨Fe2+濃度的加大，芽孢產率并沒有顯著提高，反而對芽孢生長有輕微抑制，所以放棄添加Fe2+。

圖6 Fe2+對芽孢產率的影響

4.1.7 pH值的確定

依照3.3的實驗方案，在以上述確定的參數為前提下，調節培養基的pH值分別為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，結果如圖7所示。

圖7 pH對芽孢產率的影響

由圖7結果顯示，當pH偏酸性時，芽孢的形成受到抑制。當pH為7.0時芽孢產率最高，為47.2%；當pH高于7.0時，芽孢產率逐漸降低，因此產孢最佳pH為7.0。

通過3.3的實驗，確定培養基營養成分的基本配比為：蛋白胨濃度0.8%、酵母膏濃度0.3%、NaCl濃度0.3%、Mn2+濃度為0.9mmol/L、Ca2+濃度為10mmol/L、pH為7.0，以此作為接下來產孢培養實驗的培養基成分，繼續優化產孢培養條件。

4.2 產孢培養條件的確定

4.2.1 產孢培養溫度的確定

根據3.4的實驗方案，進行培養溫度對芽孢產率的實驗，培養溫度分別設置為55、60、65、70、75℃，結果如圖8所示。

由圖8結果顯示，在菌株適應生長范圍內，隨著溫度的提升，芽孢產率有一定的提高，當溫度在65℃時芽孢產率最高，為49.7%；當溫度高于65℃時，芽孢產率逐漸降低，因此產孢最佳培養溫度為65℃。

4.2.2 產孢培養時間的確定

根據3.4的實驗方案，進行培養時間對芽孢產率影響的實驗，培養時間設為16、24、32、36、40h，每隔2～4h進行測試，結果如圖9所示。

圖8 培養溫度對芽孢產率的影響

圖9 培養時間對芽孢產率的影響

由圖9結果顯示，當培養時間為24～28h時，芽孢產率達到48%以上；當培養時間超過32h時，芽孢產率出現降低趨勢。分析出現這種趨勢的原因可知，隨著時間的變化，其培養基的營養成分已經不足以維持菌體的生長繁殖，且菌體逐漸走向衰亡期，活的菌體變少了，所轉化的芽孢便會減少。因此，產孢培養的最佳時間為24～28h。

4.2.3 接種量條件的確定

根據3.4的實驗方案，進行接種量對芽孢產率的實驗，接種量分別為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%，結果如圖10所示。

由圖10結果顯示，在一定范圍內，隨著接種量的增加，芽孢產率也隨之增加，當接種量為0.1%時，芽孢產率最高，為49.7%。當接種量超過0.1%時，芽孢產率降低，這可能是因為培養基中營養物質是一定的，當菌體數量太多時，培養基中的營養物質無法滿足菌體的生長需求，會嚴重影響嗜熱芽孢桿菌轉化成芽孢的能力，因此最佳接種量為0.1%。

圖10 接種量對芽孢產率的影響

4.3 芽孢產率的確定

根據3.5的實驗方案，進行芽孢發酵實驗，進行5次平行實驗，實驗結果如圖11顯示，經過條件優化后，芽孢產率平均可以達到47.8%。

圖11 5次實驗芽孢產率的結果

5 結果與討論

通過單因素實驗對嗜熱芽孢桿菌產孢培養條件進行優化，研究了產孢培養基組成成分（蛋白胨、酵母粉、NaCl、Mn2+、Ca2+、Fe2+、pH）以及產孢培養條件（溫度、時間、接種量），以提高嗜熱芽孢桿菌產孢率。

本文確定了嗜熱芽孢桿菌產孢培養基最佳配比：蛋白胨為0.8%、酵母粉為0.3%、NaCl為0.3%、Mn2+為0.9mmol/L、Ca2+為10 mmol/L、pH7.0、接種量為0.1%、裝液量為100mL、培養時間為24 h、溫度為65℃。Fe2+的添加對芽孢產率無促進作用。隨后通過組合條件的驗證，最終液體發酵產孢率可穩定在47.8%左右，較優化之前提高10 %以上。液體發酵雖然產孢率不如固體發酵高，但操作簡單，一次可得到的芽孢量遠遠大于固體發酵。該方法能夠提高試劑盒生產企業的工作效率并降低原材料成本。但目前產孢率仍然偏低，還需要進一步優化。