基于光譜法和計算模擬研究PFBSK與HSA的相互作用

魏雨晨, 易忠勝, 徐 婕, 趙 賽, 王海洋

(桂林理工大學 化學與生物工程學院,廣西 桂林 541006)

0 引 言

人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人體血液中含量最為豐富的載體蛋白質,約占人血漿總蛋白含量的60%[1-2]。由于HSA具有多個結合位點,使得HSA能夠結合許多的內源性、外源性物質及不同大小分子的化合物,也能與難溶于水和易溶于水的物質相結合,具有十分重要的生理意義[3]。HSA在人體血漿中起著重要的儲存和運輸作用,配體小分子進入人體內,經蛋白質轉運到達靶器官,發揮其生物學效應[4]。與人體其他的蛋白質分子相比,HSA穩定性好,溶解性也較好,與配體小分子具有良好的親和性[5-6]。由于HSA大分子具有無毒性、再生性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點[7],人血清白蛋白作為一種廣泛使用的模型蛋白被應用于各種生物化學、生命物理和藥物學等生命科學的研究中[8-10]。

全氟化合物(perfluorinated compounds, PFCs)是進入20世紀以來一類含有高能量C—F鍵的新型的環境污染物,逐漸引起科研工作者的關注[11]。由于PFCs的C—F鍵的鍵能比C—H鍵的鍵能大,從而使PFCs分子在環境中具有持久性,在經受強熱、光照、化學作用、微生物作用以及高等脊椎動物的代謝作用時依然很難被降解[12]。這類污染物在一定的劑量下會使生物體出現體重降低、線粒體受損、肝組織增重、基因誘導等不良生物學效應[13]，且具有全球普遍存在的特點,甚至于存在于人體的血液之中[14]。因此，開展PFCs小分子與HSA生物大分子的相互作用研究,闡明污染物小分子在人體內的運輸、吸收、代謝以及毒性機理有著重大的意義，也能為環境科學、化學、毒理學以及生命科學等領域提出可靠的理論依據和分析手法。

全氟化合物主要分為全氟羧酸類(perfluoroalkyl sulfonates, PFAS)和全氟磺酸類(perfluoroocatanoatc, PFCA)[15]。 全氟羧酸類化合物具有不易分解性和高沉積性, 容易隨著食物鏈進行傳遞,并在生物體內富集和放大, 其所造成的環境污染遍及全球的生態系統[16-18]。 也有研究表明，在許多的動物組織和人體中發現了PFCA[19-20]， PFCA已經成為了一類備受關注的環境污染物。 本文以全氟磺酸類化合物中的全氟丁基磺酸鉀(PFBSK， 結構式如圖1)為例, 從計算模擬和實驗分析兩方面探究PFBSK與HSA相互作用的機制。

圖1 PFBSK的結構式Fig.1 Structure of PFBSK

1 實驗部分

1.1 實驗儀器及試劑

儀器: RF-5301PC熒光光度計(日本島津公司); PHS-3CS精密pH計(上海雷磁儀器廠); EL204電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

試劑:三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液(Tris-HCl, pH=7.4); HSA(purity>97%, 美國Sigma公司)用Tris-HCl 緩沖溶液配制成濃度為1.0×10-5mol·L-1儲備液; 全氟丁基磺酸鉀(購于瑞士AD公司)用Tris-HCl緩沖溶液配制成濃度為1.0×10-3mol·L-1儲備液,搖勻, 放置于4 ℃的冰箱中,備用。除非有其他說明,否則所用試劑均為分析純,實驗用水均為二次蒸餾水。

本文所有的計算工作均通過DELL服務器上RedHat Linux 6.4系統完成。通過Sybyl X1.1軟件和 GROMACS 4.6.5軟件分別進行分子對接與分子動力學模擬,用LigPlus軟件進行分子圖形展示和結果分析。HSA晶體結構從Brookhaven蛋白質數據庫(http://www.rcsb.org/pdb)獲得(代碼為1n5u,結構相對完整)。

1.2 實驗方法

分子動力學模擬(MD):運用GROMOS96 43a1力場和周期性邊界條件,采用三點型的水模型SPC并對HSA體系和PFBSK-HSA體系建立水盒子,添加離子和溶劑使體系平衡。通過最陡下降法進行最大步數10 000步的能量最小化,隨后采用正則系統(NVT)和等溫等壓系統(NPT)平衡體系進行50 ns的MD模擬。

光譜法:將1 mL 1.0×10-5mol·L-1HSA溶液加入10 mL的比色管中, 然后用pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度線,搖勻。 之后依次加入一定量濃度為1.0×10-6mol·L-1PFBSK溶液。 在恒溫下反應8 min后,于λex=280 nm處進行掃描,激發光柵和發射光柵的狹縫寬度分別為3.0/5.0 nm,測定體系熒光光譜。同時,檢測Δλ=15 及60 nm時的同步熒光光譜。

2 結果討論

2.1 分子對接分析

分子對接可以直觀明顯地觀察出小分子與HSA的結合情況和作用力類型。 HSA由585個氨基酸殘基組成, 主要有2個結合藥物的位點, 位點Ⅰ和位點Ⅱ(也被稱為華法林位點與布洛芬位點)[3], 大部分藥物小分子都是結合在這兩個位點上。 通過運用Sybyl X1.1軟件中的Surflex Dock模塊對PFBSK與HSA進行分子對接分析。 對接的方式采用盲接,探針可自動探測結合位點。 Total-Score為Surflex Dock得分, 表達為親和力-logKd,該函數包含對極性作用、疏水作用、靜電作用和氫鍵作用等綜合因素的考慮,數值越大，表示形成的復合物越穩定[23]。

模擬結果顯示位點Ⅱ的Total-Score函數得分較高(Site Ⅰ:3.564 1, Site Ⅱ:4.492 2),說明在位點Ⅱ對接形成的復合物更加穩定。圖2a表示PFBSK在1n5u位點II處的分子對接圖。圖2b顯示PFBSK與HSA結合后PFBSK周圍5?(0.5 nm)范圍內的氨基酸殘基,PFBSK與ARG485、SER342和ARG348之間形成了6個氫鍵,從而大大提高了復合物的穩定性。圖2c為活性位點在3?(0.3 nm)范圍內疏水作用的氨基酸二維圖,參與疏水作用的氨基酸有VAL344、ALA449和ILE388等,且分布在氟原子周圍,說明PFBSK中氟原子有很強的極性。由于PFBSK的分子體積不大,能夠較容易進入到HSA的疏水腔中。圖2d為PFBSK在HSA空腔內的靜電引力作用圖,可見PFBSK進入HSA位點Ⅱ的疏水空腔中并與HSA殘基間形成了較強的靜電力。-logKd反映的是受體與配體之間的親和力, 分子對接的結果顯示該值較大,表明PFBSK與HSA之間形成的復合物具有良好的穩定性。

2.2 分子動力學模擬

分子動力學模擬可以研究復合物在水溶液中的穩定性和動力學特征。本文對游離的HSA與HSA-PFBSK形成的復合物進行50 ns動力學模擬。均方根偏差(RMSD)常用于表述構象偏差的統計值,是衡量系統穩定性的重要參數[24]。圖3a為模擬時間為50 ns的PFBSK-HSA復合物與游離HSA的均方根偏差變化情況, 可以看出在約13 ns后復合物體系和HSA體系趨于穩定。 對比游離HSA,PFBSK與HSA形成的復合物在整個模擬過程RMSD平均值較小,因此可以說明PFBSK與HSA形成的復合物更加穩定。均方根波動(RMSF)可用于描述兩個體系氨基酸殘基柔性的變化情況。圖3b為 PFBSK-HSA復合體系與游離HSA體系的均方根波動的變化趨勢,可以看出360～500號位置殘基發生異常波動,這表明PFBSK的結合位置位于HSA這些位置的殘基處,所得結果與分子對接相吻合。回轉半徑(Rg)可用來衡量蛋白質結構的緊湊程度。 從50 ns的回轉半徑的變化情況(圖3c)中可以看出每個系統的Rg值在10 ns后達到相對穩定,表示動力學模擬在10 ns后很快達到平衡。而PFBSK-HSA復合體系的Rg值低于HSA體系,這表明PFBSK的加入使HSA結構縮小,導致其空腔變小,進而引起其二級結構發生變化[25]。

2.3 結合自由能分析

結合自由能分析可以有效地預測生物大分子的結構和功能,利用MM-PBSA程序計算PFBSK-HAS體系在生理條件下的結合自由能(ΔGbind)。 本文忽略熵變對ΔGbind的影響,通過提取PFBSK-HSA復合物在MD模擬平衡(45 ～50 ns)的構象軌跡求平均值并計算得到各個能量,結果如圖4a所示, 總體的結合自由能ΔGbind為負值, 且范德華作用力EvdW、 靜電能Eelec、 非極性溶劑化能ΔGnp也均為負值, 充分表明真空中的靜電能、 范德華作用能、 非極性溶劑化能都有利于PFBSK和HSA的結合。 由于靜電溶劑化能ΔGpb對靜電作用能Eelec的抑制作用使得總體的靜電作用不利于小分子和蛋白質的結合。范德華作用能在PFBSK和HSA的結合過程中貢獻很大,此時范德華作用力是結合的主要動力。

圖2 PFBSK在HSA位點II的分子對接圖Fig.2 Molecular docking and detailed view of the interactions of PFBSK and HSA

圖3 PFBSK與HSA的分子動力學模擬Fig.3 Molecular dynamics of PFBSK and HSA

對每個氨基酸殘基在結合過程中對結合自由能的貢獻進行分析如圖4b所示。其中ARG348、ARG484、ARG485、ALA449等對兩者的結合有顯著的貢獻。結合分子對接分析,殘基ALA449表現的疏水作用使其對結合自由能的貢獻較大;而殘基ARG348和ARG485形成的氫鍵也是對結合自由能的貢獻較大的原因之一。

2.4 PFBSK-HSA的同步熒光光譜

同步熒光具有靈敏度高和選擇性好的優點,由于氨基酸殘基的最大熒光波長與其所處周圍環境的極性和疏水性有關,所以可以用其來探討蛋白質的二級結構變化及部分氨基酸的光譜特征。熒光光譜的激發和發射波長差值Δλ=15和60 nm分別為酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征。

圖5為PFBSK和HSA相互作用的同步熒光光譜圖, 隨著PFBSK濃度的逐漸增加, 蛋白質的酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強度不斷下降, 說明PFBSK對HSA的熒光發生了一定程度的淬滅作用。 色氨酸殘基(Δλ=60 nm)熒光峰的最大發射波長位置隨PFBSK濃度的增加發生了微弱的藍移(圖5b, 藍移1 nm), 而酪氨酸殘基(Δλ=15 nm)熒光峰的最大發射波長始終保持在309 nm處(圖5a),說明雖然PFBSK結合在HSA位點II的空腔, 但是并沒有對酪氨酸產生太大影響, 而是對色氨酸附近的微環境產生了較大的影響， 它破壞了色氨酸殘基附近的微環境, 增加了疏水性, 進而影響了HSA的構象, 所得結果與動力學模擬結果相吻合。

2.5 PFBSK-HSA的熒光淬滅機理

熒光光譜是一種檢測蛋白質結構變化和推斷其與小分子結合的有效手段。 當小分子與蛋白質結合的時候, 色氨酸的熒光強度會發生明顯的變化,HSA的位點Ⅰ中只存在一個色氨酸, 是HSA內源性熒光的主要來源。

圖5 PFBSK-HSA的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of PFBSK-HSA

圖4 PFBSK-HSA之間的結合自由能(a)與單個氨基酸殘基對結合自由能貢獻值(b)Fig.4 Binding free energies of PFBSK-HSA complex(a)and binding free energy contribution of each residue in the complex(b)

圖6是298 K下PFBSK和HSA的熒光淬滅圖。 HSA的熒光強度出現了明顯的藍移現象, 說明PFBSK在進入HSA的疏水腔時, 引起構象變化導致HSA的熒光發生淬滅。

圖6 PFBSK-HSA的熒光淬滅圖Fig.6 Fluorescence quench titration of HSA with increasing PFBSK concentrations

PFBSK和HSA的淬滅遵循Stern-Volmer方程[26-27]:

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ[Q]；

(1)

log((F0-F)/F)=logKa+nlog[Q],

(2)

其中,F0和F分別為PFBSK加入前、后的熒光強度;Q是PFBSK的濃度;Kq是HSA的淬滅速率常數; 而Ksv是Stern-Volmer的淬滅常數;τ表示沒有淬滅劑存在下熒光分子平均壽命, 生物大分子的熒光的熒光壽命約為10-8s;Ka是蛋白質和淬滅劑的結合常數。

蛋白質的熒光淬滅機制主要分為動態淬滅(分子間的碰撞)、 靜態淬滅(淬滅劑和蛋白質形成復合物)和非輻射能量轉移等幾種機制，分別在溫度為291、298和310 K時加入PFBSK，HSA-PFBSK體系的熒光強度的變化如圖7a所示?？梢?，隨著溫度升高，Ksv減小,Kq大于各類淬滅劑對蛋白質大分子的最大分散碰撞常數(2×1010L·mol-1·s-1),淬滅劑與具有熒光物質的HSA在基態時發生了配合反應,PFBSK進入了HSA的空腔,蛋白質原有的微環境和二級結構產生了變化,從而導致的靜態淬滅。

用修正的Stern-Volmer方程(式(2))可以得到不同溫度下PFBSK濃度對HSA-PFBSK體系熒光強度的雙對數曲線,由該直線的斜率和截距可求出PFBSK與HSA結合位點數n及表觀結合常數Ka(圖7b)。

由表1可知,PFBSK濃度對HSA-PFBSK體系熒光強度的雙對數曲線在不同溫度下都具有良好的線性關系。它們相互作用的結合常數在105L·mol-1數量級以上,結合較穩定。結合位點數n約等于1,說明在PFBSK與HSA作用時只存在1個結合位點。這與分子對接和動力學模擬結果都存在高度的一致性。

2.6 PFBSK與HSA能量轉移的研究

F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移理論常被用于研究大分子體系中兩個發光基團間的距離。理論方程[28-29]可計算能量供給體和受體間的結合信息

圖7 PFBSK濃度與F0/F及lg((F0-F)/F)的關系Fig.7 Q-F0/F and lg Q-lg((F0-F)/F) diagrams

表1 PFBSK與HSA體系在不同溫度下的表觀結合常數Ka、熒光淬滅常數Ksv及結合位點n

(3)

(4)

J=(∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ)/(∑F(λ)Δλ),

(5)

式中:E為PFBSK與HSA二者間的能量轉移效率;R0為能量轉移距離；K2=2/3;N為介質的折射常數(取水和有機物的平均值1.336);Φ為熒光量子產率(0.15);J為熒光發射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。

圖8是PFBSK的紫外吸收光譜和HSA的熒光發射光譜的重疊圖,根據F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移機理通過式(3)～(5)計算得出給體與受體間能量轉移的效率E、重疊積分J和結合距離r。由表2依據式(3)～(5)求出的給體與受體之間的距離r值等于3.71 nm(小于7 nm), 且0.5R

圖8 PFBSK紫外吸收光譜與HSA熒光光譜的重疊圖Fig.8 Overlap of fluorescence spectrum of HSA and absorbance spectrum of PFBSK

J/(cm3·L·mol-1)ER/nmr/nm2.11×10-140.01822.883.71

2.7 PFBSK與HSA作用力類型的確定

小分子與生物大分子之間結合的相互作用力包括靜電引力、氫鍵、范德華力和疏水作用力等。通過熱力學方程[30]

lnK2/K1=ΔH(1/T1-1/T2)/R；

(6)

ΔG=-RTlnK；

(7)

ΔS=-(ΔG-ΔH)/T,

(8)

可計算反應的焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能變化(ΔG), 并由此判斷小分子和生物大分子之間的主要作用力類型。 其中，K為結合常數,R=8.314 51 J·mol-1·K-1。

根據熱力學參數可以判斷作用力的類型,當ΔG<0時表示反應可以自發進行,若ΔH>0,ΔS>0時,主要表現為疏水作用力;若ΔH<0,ΔS<0時,則是氫鍵和范德華力起主要作用;若ΔH<0,ΔS>0時,則靜電作用處于主導地位。計算不同溫度下(T=291、 298、 310 K),PFBSK與HSA相互作用時的體系熱力學參數,如表3所示。

表3 不同溫度下PFBSK與HSA相互作用的熱力學常數

當溫度變化不大時,可認為焓變ΔH是一個常數。該體系ΔG<0,ΔH<0,ΔS<0,說明PFBSK與HSA的相互作用的主要類型為氫鍵和范德華作用力,這與分子對接和結合自由能分析所得的結論相一致。

3 結 論

本文通過分子對接和動力學模擬從分子水平上對PFBSK與HSA的相互作用進行計算模擬和理論推測。分子對接結果和關鍵氨基酸殘基分析表明PFBSK與HSA主要結合在位點Ⅱ處,其相互作用力主要體現為氫鍵和范德華作用力并伴有疏水作用力與靜電引力。分子動力學模擬各種參數的結果顯示:PFBSK與HSA之間形成的復合物比游離的HSA具有更好的穩定性,同時PFBSK與HSA的結合使得HSA原本的微環境發生變化,從而導致HSA的二級結構發生變化,所得的結果與分子對接相吻合。結合自由能分析中貢獻較大的是范德華作用力和疏水作用力。實驗和模擬結果表明HSA與PFBSK結合是由疏水作用力、靜電引力并伴隨著氫鍵和范德華力共同作用的結果。熒光光譜法得出PFBSK導致HSA的熒光淬滅機制為靜態淬滅并發生非輻射能量轉移;通過對熱力學參數的計算,焓變和熵變均為負值,說明PFBSK與HSA之間的主要作用力為氫鍵和范德華作用力;同步熒光和能量轉移實驗表明PFBSK與HSA的相互作用使HSA的構象發生改變,實驗結果與分子對接和動力學模擬所得的結論高度一致,為今后探究全氟磺酸類化合物與HSA的研究提供了可靠的參考信息與分析手法。