DHEA對小鼠超排卵和卵母細胞質量的影響*

何 巖 于 洋 董婉維 周生來 王 惟 楊 葳 鄭志紅

(中國醫科大學實驗動物部，沈陽 110000)

脫氫表雄酮(DHEA)及其硫酸鹽(DHEAS)是一種C19類固醇激素，由腎上腺與性腺(睪丸和卵巢)分泌，是外周血睪酮和雌二醇的前體[1]。DHEA在體內大部分以硫酸鹽的形式存在，并對生殖系統有重要的作用。已有研究證明，DHEA可以顯著改善臨床妊娠率[2]，出生率，子宮內膜的厚度和恢復卵巢功能[3]。對于卵巢功能減退(diminished ovarian reserve，DOR)的患者，體外補充DHEA可以改善體外受精的效果。有研究人員比較DOR患者使用DHEA治療前后，試管嬰兒的胚胎數和分級顯著升高[4]。因此，DHEA可以提高懷孕率，降低流產率[3]。此外，對于生理性或者病理性卵巢功能減弱的女性，體外補充DHEA可以恢復卵巢功能[4]。用4-乙烯基環己烯二氧化二甲苯誘導大鼠的DOR模型中，經過DHEA處理后，卵巢組織中閉鎖卵泡的數量明顯減少[5]。在綿羊的DOR模型中，DHEA可能通過調節AMH的表達促進卵泡的發育[6]。但是DHEA作用機制仍不清楚，基于DHEA可以減少閉鎖卵泡的數量，恢復卵巢功能，那么它是否可以作為一種輔助用藥提升超排卵的效果，目前尚無報道。由于使用激素進行超排卵本身對于卵母細胞的質量有不良影響[7]，本研究旨在以C57BL/6J雌鼠為研究對象，探索DHEA是否能夠提高C57BL/6J雌鼠的超排卵效果以及卵母細胞的質量，以進一步探討DHEA改善超排卵的機制。

卵母細胞的質量直接影響后續的實驗效率以及實驗結果，過去對于卵母細胞的質量評價多通過形態學的方法，現在越來越多的研究認為，卵丘細胞可以作為一項指標來評價卵母細胞甚至是胚胎的質量。卵丘細胞是顆粒細胞包圍卵母細胞形成的，累積卵母細胞周圍形成卵丘復合體(COC)，其在卵泡發育中起到促進卵母細胞發育和成熟的作用。卵丘復合物與卵母細胞通過特殊的連接間隙，進行雙向的傳遞信號。若除去卵丘復合物與卵母細胞之間的連接，會導致卵母細胞質量降低，胚胎發育不良，妊娠失敗[8]。因此，可以通過鑒定卵丘細胞中某些基因的表達來評價卵母細胞的質量和體外受精的結果。許多相關研究報道，卵丘細胞中Grem1、Has2、Ptgs1、Ptgs2和Vcan等基因的表達標志著卵母細胞的成熟能力[9]、胚胎質量及發育、妊娠的結果和活產率的高低[10]。本研究試圖用DHEA處理C57BL/6J雌鼠，然后誘導超排卵，檢測DHEA作用后超排卵效果以及卵丘細胞中標志卵母細胞質量的基因表達水平，從而鑒定卵母細胞質量，并初步探索DHEA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:近交系3周齡C57BL/6J雌鼠30只，雄鼠5只，所有SPF級小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號 SCXK (京)2016-0006。所有實驗小鼠均飼養于中國醫科大學實驗動物部SPF級動物房，飼養條件：溫度控制在(22±3)℃，自動光控(12 h/12 h)。

1.1.2試劑:孕馬血清促性腺激素(PMSG，C151214，寧波市激素制品有限公司)，絨毛膜促性腺激素(HCG，S160113，寧波市激素制品有限公司)，M16培養液、HTF培養液、KMSO培養液、礦物油和透明質酸酶(Sigma 美國)，單細胞RNA提取試劑盒(sigma 美國)。

1.1.3儀器設備:體視顯微鏡(OLYMPUS 日本)，胚胎移植管(自制)，熱臺(OLYMPUS 日本)，常規手術器械(瑞沃德 中國)，電子天平(梅特勒 美國)，發光儀Roche LightCycler?96(Roche 瑞士)，電熱恒溫培養箱(Eppendorf 德國)。

1.2 方法

1.2.1超排與取卵:C57BL/6J雌鼠30只，腹腔注射PMSG 5 IU /只，間隔48 h后再次腹腔注射相同劑量的HCG，于腹腔注射HCG 15 h后取卵，動物經頸椎脫位法處死，取出壺腹膨大部顯微鏡下取卵。將每組的10只隨機選取5只進行體外受精，另5只進行卵丘細胞的分離收集。

1.2.2體外受精:按Nakagata[11]的方法，取3月齡的C57BL/6J雄鼠2只，頸椎脫位法處死，分別取其附睪尾，沿與曲細精管垂直方向剪口，用滅菌的解剖針從附睪尾部挑取一滴濃密的精液，放入已預培養的HTF培養液中，于CO2培養箱37 ℃條件下進行培養獲能1.5 h，并以血球計數板計數該精子懸濁液的濃度。將適量獲能后的精子分別放入含未受精卵的培養液中，使其精子終濃度為200個/μL，然后放入CO2培養箱中受精6 h。 體外受精6 h 后在實體顯微鏡下觀察受精情況，將有二極體和雙原核的卵判定為受精卵。計算受精率，次日紀錄2細胞胚胎數、未受精卵數、異常卵數和卵總數，統計受精率和異常卵比例。

1.2.3Real-time PCR：檢測卵丘細胞中基因轉錄水平：通過1.2.1中的方法超排卵，經過透明質酸酶消化分離卵丘細胞和卵母細胞，收集卵丘細胞，按單細胞RNA提取試劑盒說明書步驟提取卵丘細胞總RNA，采用TAKARA反轉錄試劑盒進行反轉錄，應用Roche LightCycler?96進行Real-time PCR(SYBR Green熒光染料購自TAKARA公司)。表1為qRT- PCR 引物序列。目的基因和內參基因β-actin分別在同一批次的96孔板上、不同的PCR管中擴增。PCR總反應體系為20 μL，上、下游引物各1 μL，1∶100稀釋后的cDNA模版1 μL，ddH2O 7 μL，SYBR 10 μL。95 ℃預變性30 s后，再進行如下40個循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。每一份標本進行復管檢測。得到各管標本的擴增曲線和目的序列的Ct值，以及檢測該管標本內參基因β-actin的Ct值，計算各管標本的待測序列的ΔΔCt值[ΔΔCt=(待測目的基因Ct值-待測組內基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值)]，則該基因的mRNA相對表達為2—ΔΔCt。

表1 qRT-PCR引物序列5′-3′Table 1 qRT-PCR primer sequence 5′-3′

1.3 統計方法

采用SPSS 19.0統計軟件包進行統計分析，采用獨立樣本t檢驗和卡方χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 超排卵和受精情況

3周齡C57BL/6J雌鼠經過低劑量(2 mg/kg·d-1)和高劑量(5 mg/kg·d-1)DHEA灌胃一周，經激素超排卵后，表2統計結果顯示，總卵數：低劑量處理組與高劑量處理組排卵數量與對照組比較略升高。異形卵數及比率：實驗組與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義，P<0.05。受精率：實驗組與對照組比較沒有明顯差異。說明DHEA可以顯著降低經過激素超排卵后異形卵比例，但對于超排卵總數量和受精率影響不大。

表2 超排卵后卵母細胞形態以及受精率的變化Table 2 Changes of oocyte morphology and fertilization rate after superovulation

注：受精率=2-cell數/總卵數，異常卵比率=異常卵數/總卵數.*P<0.05

Note：Fertilization rate=No. of 2-cell embryos / total number of oocytes, abnormal oocytes rate=No. of abnormal oocytes / Total number of oocytes.*P<0.05

2.2 卵丘細胞中胚胎質量相關基因轉錄水平

圖1中卵丘細胞中mRNA表達水平顯示，DHEA處理組Grem1表達水平與對照組相比降低，且高劑量組比低劑量組降低的倍數更大。DHEA對于Ptgs2的mRNA水平與其對Grem1的表達水平有相似的結果，即實驗組mRNA水平比對照組降低。而另外的胚胎質量相關標記物Has2、Vcan和Ptgs1的mRNA水平如圖2顯示，實驗組與對照組比較顯著上調。Has2上調最明顯。以上差異均有統計學意義。

圖1 卵丘細胞中胚胎質量相關基因下調基因表達情況注：橫坐標中，High：高劑量處理組；Low：低劑量處理組；Con：對照組縱坐標表示基因mRNA表達水平的倍數.**P<0.01，***P<0.001Fig.1 Downregulation of genes related to embryo quality in cumulus cellsNote：In abscissa, High: high dose group; Low: low dose group; Con: control group. Longitudinal coordinates represent multiple levels of gene expression.**P<0.01，***P<0.001

2.3 卵丘細胞中凋亡相關基因轉錄水平

圖3中卵丘細胞中凋亡相關基因Caspase3表達水平顯示，DHEA處理組與對照組相比顯著下調，高劑量組下調倍數比低劑量組更明顯，即低劑量組下調0.8倍，高劑量組下調0.3倍。Bcl2l10的mRNA表達水平顯示，實驗組mRNA表達水平高于對照組。以上差異均有統計學意義。

圖2 卵丘細胞中胚胎質量基因表達上調基因表達情況注：橫坐標中，High：高劑量處理組；Low：低劑量處理組；Con：對照組。縱坐標表示基因mRNA表達水平的倍數。**P<0.01，***P<0.001Fig.2 Upregulation of genes related to embryo quality in cumulus cellsNote：In abscissa, High: high dose group; Low: low dose group; Con: control group. Longitudinal coordinates represent multiple levels of gene expression.**P<0.01，***P<0.001

圖3 卵丘細胞中凋亡相關基因表達情況注：橫坐標中，High：高劑量處理組；Low：低劑量處理組；Con：對照組。縱坐標表示基因mRNA表達水平的倍數。**P<0.01，***P<0.001Fig.3 Expression of apoptosis-related genes in cumulus cellsNote：In abscissa, High: high dose group; Low: low dose group; Con: control group. Longitudinal coordinates represent multiple levels of gene expression.**P<0.01，***P<0.001

3 討論

Has2是透明質酸合成酶，是卵丘細胞擴張的重要因素，能夠促進卵母細胞成熟和排卵[12]。Ptgs1、Ptgs2是前列腺素內過氧化物合酶1和2，二者在排卵反應中參與細胞外基質的形成與信號傳導，其表達水平的高低預示著卵母細胞的質量。Vcan是多功能蛋白聚糖，是經過排卵刺激后產生的蛋白多糖，其N’端可以與蛋白質功能結構域結合，C’端與ERF受體、整合素等細胞表面蛋白相互作用。其表達在卵母細胞成熟、排卵和受精過程中起重要作用[13]。Grem1基因編碼的蛋白屬于分泌性蛋白，且具有高度保守性，是骨形態形成蛋白(BMP)拮抗劑家族成員，在胚胎發育的早期表達量高，并發揮重要作用[14]。有研究報道顆粒細胞中Has2、Ptgs1、Ptgs2以及Vcan的轉錄水平與卵丘的擴增有關，其表達水平越高卵母細胞的質量越好[15]。

本研究發現，C57BL/6J雌鼠經過DHEA灌胃一周，超排卵后，與對照組相比，排卵數量沒有明顯提升，但是異常卵比率明顯下降。DHEA可以提高顆粒細胞中Has2、Ptgs1和Vcan基因的轉錄水平，優化了卵母細胞的質量。因此，DHEA可以作為一種輔助用藥促進C57BL/6J青春期前雌鼠的超排卵質量。本研究中用DHEA處理后，卵丘細胞中Ptgs1的轉錄水平上調而Ptgs2的轉錄水平下調，這可能與Ptgs1與Ptgs2出現表達的時間有關，Ptgs1的表達出現在超排卵后的12 h，相當于排出第一級體后開始表達，而Ptgs2的表達出現較早，發生在超排卵后4～8 h，排卵后表達隨之降低。兩種同源基因表達存在時空差可能是Ptgs1與Ptgs2存在功能互補的原因[13]。Grem1也是較多研究者認為可以標志著卵母細胞和胚胎質量的基因[15]，但是Myers等人報道了Grem1在原始卵泡形成前起到重要的作用，出生后Grem1的表達并不能代表胚胎質量和受精能力，本研究中DHEA使Grem1下調的機制可能是由于Grem1是BMP4信號通路的拮抗劑，應用DHEA處理時，激活BMP4信號通路，因此降低了Grem1的表達[14]。綜上，DHEA可以優化青春期前卵母細胞的質量，DHEA對于成年C57BL/6J小鼠的作用效果還有待于進一步研究。

對于DHEA作用機制的研究，一方面的關注DHEA對相關激素的調節，例如DHEA可以通過增強抗繆勒管激素(AMH)、抑制素B，增加有腔卵泡的數量，改善DOR患者的卵巢功能[16]。但是也有研究者發現DHEA對于血清AMH和FSH并沒有明顯改變[17]。另一方面，DHEA可能通過增加對胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的表達從而增加卵巢的反應性[18]。此外，雌鼠缺乏雄激素受體(AR)表現出較長的發情周期和較低的生育能力[19]，因此有研究報道DHEA可通過誘導顆粒細胞中雄激素受體(AR)和FSH受體的表達增加，恢復卵巢的功能[20]。但是，也有文獻報道，DHEA可以增加DOR患者AR的表達，但并沒有增加FSH受體的表達，相反DHEA可以降低DOR患者中高表達的FSH受體水平，表明DHEA調節FSH受體的機制可能存在其他方式[21]。近年還有研究報道，對于卵巢反應性低下的女性，DHEA可以通過減少其卵丘細胞的凋亡，增加線粒體的功能，提高卵母細胞的質量和體外受精的結果[22]。在本研究用DHEA處理C57BL/6J小鼠并超排卵后，卵丘細胞中凋亡相關基因Bcl2l10與對照組相比表達上調，Caspase3表達與對照組相比表達下調，與Lin 等人的研究結果一致。本研究發現DHEA可以提高卵母細胞的質量，降低經過激素超排卵后異形卵的比例，并對DHEA影響卵丘細胞發育的機制做了初步探索，為后續DHEA的功能研究提供基礎理論。