高脂血癥食蟹猴模型的建立及分析

楊永立 李 鋒 汪云龍 劉發琴 周國春 高仕平 徐子辰 徐永德

(昆明科靈生物科技有限公司，昆明 650550)

隨著人們生活水平的提高，高血脂癥(Hyperlipidaemia)和脂肪肝(fatty liver)的發病率在逐年增加。高血脂癥，又稱脂代謝紊亂，即血清總膽固醇(Total Cholesterol, TC)，甘油三酯(Triglyceride, TG)，低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL)的增高以及高密度脂蛋白(high-density lipoprotein HDL)的降低，這不僅是脂代謝紊亂的標志，也是動脈粥樣硬化，冠心病、腦卒中、高血壓、心臟病，中風和脂肪肝等疾病的主要危險因素[1-4]。高脂血癥已成為醫藥界研究的熱點，理想的高脂血癥動物模型不僅是研究人類高脂血癥發病機理的有效工具，也是開展脂代謝異常及動脈粥樣硬化研究的重要手段。

建立高脂血癥模型的動物，要考慮造模動物對膳食脂質調節和代謝、生理功能反應以及高脂血癥的各種癥狀等要與人類盡可能相似。非人靈長類動物因在遺傳、生理以及生物學特性方面與人類十分相似，高脂血癥動物所表現的病理特征和血脂變化規律與人類高血脂患者的臨床特征也十分相似[5]，故選用食蟹猴作為實驗動物，用高脂膳食飼料誘導方法，初步建立高脂血癥食蟹猴動物模型，本研究通過檢測TC、HDL、LDL、TG的水平來衡量血脂變化情況，同時對其血脂指標變化趨勢進行分析，為篩選理想的高脂血癥模型提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物: 正常飼養的健康成年雄性食蟹猴804只，由昆明亞靈生物科技有限公司提供，許可證號為SCXK(滇)K2015-0003；實驗過程在生物醫學動物模型國家地方聯合工程研究中心昆明科靈生物科技有限公司動物實驗設施中進行，實驗動物使用許可證號為SYXK(滇)K2012-0002。

1.1.2實驗飼料:正常飼料由昆明亞靈生物科技有限公司提供，生產許可證號為SCXK(滇)K2018-0004。高脂飼料由廣州市國龍科技有限公司提供，(加工配方：15%豬油、30%糖、0.5%膽固醇、5%無營養物質、49.5%基礎飼料)，生產許可證號為SCXK(粵)2014-0026。

1.1.3主要試劑及儀器設備:膽固醇，高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三脂檢測試劑盒由羅氏診斷產品(上海)有限公司提供。使用羅氏全自動生化分析儀(c501)檢測血清樣品。

1.2 方法

1.2.1動物分組及高脂血癥動物模型的制備:隨機挑選435只食蟹猴為模型組，飼喂高脂膳食飼料；369只為對照組，飼喂正常飼料。模型組和對照組動物每天每只飼喂200 g飼料，分別在上午08：00和下午16：00各給予100 g。每日中午13：30飼喂150 g水果，自由飲水。飼養環境溫度18～26 ℃，相對濕度40%～70%，本試驗分別在第4個月、第8個月、第12個月、第18個月采血進行血脂檢測。

1.2.2血液樣品采集及血脂檢測:動物空腹12～14 h，前肢靜脈采血3 mL，3 000 r/min 離心10 min后收集血清。馬上使用羅氏全自動生化分析儀(c501)檢測TC,HDL,LDL和TG。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 高脂膳食誘導組造模前、后血脂指標檢測結果比較

高脂膳食誘導組血脂指標與造模前自身對照，TC、HDL、LDL在飼喂高脂膳食飼料4個月后明顯升高，在4～12個月均維持在較高水平，18個月略下降，但與實驗前相比均極顯著上升(P<0.01); TG在飼喂高脂膳食飼料8個月后明顯升高，并維持在較高水平，與實驗前相比差異極顯著(P<0.01)。

2.2 高脂膳食誘導組與正常飼料對照組血脂指標檢測結果比較

造模后，高脂膳食誘導組與正常飼料對照組比較，TC、HDL、LDL、TG均高于對照組，差異極顯著(P<0.01)。

2.3 對照組、模型組實驗前后血脂指標檢測結果比較

血脂各項指標的分析結果表明，在實驗過程中，對照組血清TC、HDL、LDL、TG均無明顯的變化。模型組TC水平有遞增趨勢，在飼喂高脂膳食飼料4個月后，與實驗前相比呈現極顯著性差異(P<0.01),并且TC明顯高于食蟹猴血脂的正常參考水平，具備了高膽固醇血癥特征；HDL先增加后降低，但與實驗前相比均極顯著上升(P<0.01)；LDL在飼喂高脂膳食飼料4個月后水平快速遞增，雖然后期有下降，但都維持在較高水平，并且與實驗前相比極顯著上升(P<0.01)，且明顯高于食蟹猴血脂的正常參考水平，提示脂代謝紊亂導致了高脂血癥；TG水平呈現遞增趨勢，在8個月時極顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 食蟹猴高脂血癥模型組與對照組血脂指標監測結果Table 1 Indexes about lipids of the model group and the control

注：TC, HDL, LDL, TG 單位均為mmol/L。同列字母相同表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異極顯著(P<0.01)

Note：The units of TC, HDL, LDL and TG are all mmol/L, The same letter in the same trade means no significant difference(P>0.05),while different letter means significant difference or extremely significant(P<0.05,P<0.01)

2.4 高脂膳食誘導組血脂檢測指標TG水平

飼喂高脂膳食飼料動物的TG水平，個體間存在較大差異。TG代謝極端異常的動物TG水平可突然升高至57.6 mmol/L, 而飼喂相同時間高脂膳食飼料的動物TG水平最低的為 0.1 mmol/L。

3 討論

非人靈長類動物是現代醫學研究領域重要的實驗動物，在遺傳學、解剖學和生理學上都與人類高度相似。食蟹猴體型小，性情溫順，便于實驗操作，且繁殖周期短，在醫學研究中應用廣泛，常應用于藥理學、毒理學、藥物安全性評價等方面的實驗研究[6]。

本試驗選擇生長和代謝都較為穩定的成年食蟹猴作為實驗猴[7]，通過飼喂高脂膳食飼料形成高脂血癥動物模型，該模型形成時間相對較長，與人類長期高脂膳食導致的高脂血癥相似。脂代謝紊亂是誘發高脂血癥的關鍵原因，血清中TC、HDL、LDL、TG的含量可在一定程度反映機體脂肪代謝狀況，是監測血脂變化的重要指標[8]。TC體內含量過量時會導致高膽固醇血癥，對機體產生不利的影響；HDL主要功能是將肝外組織中過多的膽固醇運輸到肝臟代謝，HDL具有防止動脈粥樣硬化、降低冠心病病死率作用；LDL是所有血漿脂蛋白中首要的致動脈粥樣硬化性脂蛋白，如果血液中LDL含量過高，就易沉積于動脈血管壁，會形成粥樣斑塊，導致血管狹窄或破裂可直接導致急性心梗、中風甚至猝死。本實驗通過檢測TC、HDL、LDL、TG的水平來衡量血脂變化情況。

本實驗結果顯示，在飼喂高脂膳食飼料4個月時，試驗組TC和LDL水平極顯著升高(P<0.01)，在后期有所下降，但都穩定維持在一個較高的水平，且TC 和LDL的水平明顯高于食蟹猴血脂的正常水平[9-11]；HDL和TG水平先增加后降低，雖然與實驗前相比有極顯著的上升(P<0.01)，但均維持在食蟹猴血脂的正常水平；在實驗8個月、18個月時模型組TC、HDL、LDL、TG均明顯高于對照組(P<0.01)尤其是TC和LDL的水平，這一結果與楊鳳梅等的實驗結果一致[11]。造成這些結果的可能機制是因為高脂膳食飼料中含15%的豬油、30%的糖和0.5%膽固醇，高脂肪、高糖和高TC的攝入使造模動物體內血液的TC含量急劇增加，出現TC代謝障礙從而導致機體內的血脂代謝紊亂，使LDL的代謝也出現障礙并在體內蓄積，從而使造模動物出現高TC和高LDL血癥。通過分析TG的結果可知，飼喂高脂膳食飼料動物的TG水平，個體間存在較大差異，造成這一結果的原因可能是動物個體間基因存在差異，有些動物的基因在特定的身體條件和環境因素作用下會發生突變。有全基因組研究發現，TG代謝極端異常的HTG患者，脂蛋白(lipoprotein lipase, LPL)基因，載脂蛋白C2基因有突變聚集傾向[12]。脂蛋白脂肪酶的主要生理功能是水解血液中富含甘油三脂脂蛋白中的三脂酰甘油，生成的甘油和脂肪酸可供組織氧化分解并提供能量[13]。有些LPL 自身變異并結合遺傳因素或者環境因素時會產生嚴重的臨床癥狀，比如妊娠后,LPL 基因發生突變，TG由3.4 mmol/L 升高至22.5 mmol/L[14]。

本實驗結果說明，采用高脂膳食飼料建立的食蟹猴高脂血癥動物模型前期表現為TC和LDL迅速升高，后期雖有下降，但都維持在較高的異常水平，這一結果表明食蟹猴在造模過程中可能存在一個機體內適應的過程，通過體內代謝調節血脂水平，維持在一個穩定的水平；HDL和TG水平先增加后降低，但都在正常范圍內波動。通過各項指標分析，用高脂飼料建立的食蟹猴高脂動物模型符合高脂血癥臨床分類中的高膽固醇血癥和高LDL血癥的特征，并且在18個月的試驗監測中，TC和LDL都維持在較高水平，說明本試驗已經初步建立了穩定的食蟹猴高脂血癥動物模型。