Ⅰ型干擾素受體(Ifnar)基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定

陳亞坤 孫 婧 蔣亞君 王昕昉 劉曉宇 戴連攀 盧選成 李曉燕

(1. 中國疾病預防控制中心，北京 102206)(2. 中科院北京生命科學研究院，北京 100101)

干擾素(Interferon，IFN)是能夠干擾病毒在宿主細胞內增殖的一種蛋白，1957年由Isaacs與Lindenmann共同發現。干擾素分為I型干擾素和Ⅱ型干擾素兩大類[1]。I型干擾素包括IFN-α和IFN-β，Ⅱ型干擾素也稱為IFN-γ[2]。干擾素生物效應發揮的前提是，必須要與細胞表面相應的信號受體結合[2-3], 如果干擾素受體缺乏，會導致干擾素無法與之結合，進而無法發揮干擾素的生物學效應。干擾素受體(IFNR)分為I型干擾素受體(結合I型干擾素)和Ⅱ型干擾素受體(結合Ⅱ型干擾素)，干擾素受體基因敲除小鼠屬于免疫缺陷動物模型，是多種病毒研究的敏感動物模型，可用于病毒的致病機制研究以及抗病毒疫苗、藥物研發。中國疾病預防控制中心實驗動物中心通過引進I型干擾素受體(Ifnar)基因敲除小鼠，并在負壓屏障設施內以1雄2雌的合籠方式進行了飼養、保種繁育，并對繁育的仔鼠基因型進行了鑒定，結果獲得了穩定的ifnar-/-基因型小鼠。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Ifnar基因敲除小鼠純合子自重慶醫科大學引進，品系名：B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax， 遺傳背景：C57BL/6，基因型：ifnar-/-。

1.2 儀器和試劑

PCR擴增儀(杭州博日科技有限公司，型號：TC-XP-D)，化學發光凝膠成像系統(北京科創銳新生物科技有限公司，型號：K8360)，核酸水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司， 型號：DYCP-31DN)，臺式高速冷凍離心機(艾本德中國，MiniSpin)，恒溫水浴鍋(上海習仁，型號：HH-12)，實驗動物飲水機(北京木牛流馬精華工程技術有限公司， MN-LM200 J)；動物飲水專用滅菌器(凌云博際北京科技有限公司，Ⅲ型)。

基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司， 貨號：EE101)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司， 貨號： AS111)，2 K DNA Marker(北京全式金生物技術有限公司，貨號：BM101)， Biotium Gelred核酸染料(10000×)(萊博斯特(北京)科技有限公司，貨號：41003)。

1.3 Ifnar基因敲除小鼠的飼養繁育

Ifnar基因敲除小鼠飼養在中國疾病預防控制中心實驗動物中心負壓屏障設施內[4], 在獨立通風籠盒(individually ventilated cages，IVC)內飼養和繁殖，飼養溫度控制在20～24 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲食進水，晝夜光照節律。按照SPF級動物飼養標準進行飼養，墊料、鼠盒均經過131 ℃、15 min 高壓蒸汽滅菌后使用。飼料采用華阜康公司生產的SPF級小鼠飼料,小鼠飲水采用超濾凈化水機生產后再高壓滅菌處理。墊料每周更換1次,每日補充充足飼料及飲水。采用1雄2雌合籠方式進行繁殖。

對14籠合籠的純合Ifnar基因敲除小鼠(5～10個月月齡)的生產情況進行4個月的跟蹤，對生產的仔鼠數量進行統計計算。

1.4 小鼠的基因型鑒定

1.4.1鼠尾基因組DNA提取:剪取小鼠尾尖長0.2～0.3 cm的組織，放入容量1.5 mL離心管中，快速放入-20 ℃保存。用DNA提取試劑盒提取小鼠基因組DNA后，放于4 ℃備用。

1.4.2PCR擴增反應:鑒定引物序列由上海生工生物工程技術服務股份有限公司合成， Common：CGAGGCGAAGTGGTTAAAAG, Wild type Reverse：ACGGATCAACCTCATTCCAC, Mutant Reverse：AATTCGCCAATGACAAGACG。以上3種引物按照1∶1∶1比例混合至10 μmol/L，進行PCR反應。PCR反應體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，引物混合物 1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌ddH2O 7 μL。采用PCR擴增儀進行Touchdown循環擴增，反應條件：預變性94 ℃ 2min；變性94 ℃ 20 s，復性65 ℃ 15 s，復性溫度每個循環下降0.5 ℃，延伸68 ℃ 10 s，循環10次；變性94 ℃ 15 s；復性60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 10 s，循環28次；最后延伸72 ℃ 2 min；10 ℃停留。最后樣品取出,4 ℃保存備用。

1.4.3瓊脂糖凝膠電泳:取PCR擴增產物1 μL，在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳分析，以120v由負極向正極電泳30 min，于化學發光凝膠成像系統中拍照觀察。

1.4.4基因型結果判定:按條帶不同鑒別出各個基因型小鼠。鼠尾基因組DNA經PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳基因型片段為:Common和 mutant reverse 引物擴增產物長度為250 bp左右，為突變型(KO)小鼠；Common和 Wild type reverse引物擴增產物長度為155 bp左右,為野生型(WT)小鼠；250 bp和155 bp兩條電泳條帶均存在的為雜合(HET)小鼠。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 小鼠外形特征

C57BL/6(=B6)遺傳背景的Ifnar基因敲除小鼠成年鼠的被毛為黑色，與野生型B6小鼠相同。Infar基因敲除小鼠交配后產生的子代新生幼鼠, 兩眼緊閉，四肢蜷縮，皮膚無毛，呈肉紅色,與野生型幼鼠外觀形態上無明顯差異。

圖1 基因敲除小鼠的成年鼠和仔鼠外形特征注：A.成年小鼠 B.1日齡仔鼠Fig.1 Appearance of adult and neonatal knockout miceNote：A. adult mouse B. neonatal mice

2.2 小鼠的繁育情況

Ifnar基因敲除母鼠妊娠期為20 d左右，哺乳期為21 d左右，小鼠的性成熟期為45～60 d，以上小鼠生理特性和野生型無明顯差異。但在產仔數量上，大多在每胎10只以下，較野生型每胎8～15只低。對14籠5～10個月月齡小鼠的生產情況進行4個月的跟蹤，對生產的仔鼠數量進行統計計算。在4個月期間14籠小鼠共計生產41胎， 產仔數量總數為225只，平均每胎為(5.6±2.7)只，和野生型理論值每胎8～15只相比較，差異極顯著(P﹤0.01)，具有統計學意義。

2.3 小鼠基因型鑒定結果

部分小鼠鼠尾基因組DNA擴增產物鑒定結果如下圖：N為陰性水對照，未見條帶。1號樣品條帶在155 bp位置左右，為野生型，2～8號樣品條帶在250 bp位置左右，為I型干擾素受體(ifnar)基因敲除小鼠。

圖2 部分小鼠PCR基因型鑒定結果注：M:Marker(2 kb DNA marker)1：野生型樣品 2～8：不同樣品 N:陰性對照Fig.2 Results of genotype identification of some mice by PCRNote: M:Marker(2 kb DNA marker)1:wild type 2～8: Different samples N: Negative control

3 討論

在敲除小鼠的飼養過程中，其外觀形態、性成熟時間、妊娠時間，哺乳時間等，與野生型小鼠相比未見明顯差異。但在產仔數量上，敲除小鼠(5.6±2.7)只明顯較野生型每胎產仔數量少，和理論值每胎8～15個存在極顯著差異。當然,不排除飼養條件,環境因素等對小鼠的生殖能力造成影響,但經觀察,同等條件下本中心其他小鼠具有和理論值相當的生殖能力。并且本研究中產仔數量的差異與王曉東等[6]的實驗結果相一致，他們對三種品系的基因敲除小鼠產仔數量進行研究，結果表明，三種基因敲除小鼠平均每胎產仔數量與其背景小鼠相比均低，其中II型干擾素受體基因敲除小鼠平均每胎產仔數為(5.25±0.82)只。因此綜合以上結果推測，某些基因的敲除可能會影響敲除小鼠的繁殖能力。本研究中Ifnar敲除小鼠產仔能力較低，可能是由于I型干擾素受體基因的敲除影響了某些基因的調控表達，使敲除小鼠的某些功能喪失，造成生殖功能障礙。但這種差異是否確實與基因敲除有關，還需要進一步研究。

基因敲除小鼠繁育保種的一個重要環節就是基因型鑒定，方法主要包括PCR法和傳統的Southern bolt法[7]。本研究采用試劑盒提取鼠尾組織基因組DNA，參照Jackson Laboratory提供的引物序列，通過普通PCR擴增,凝膠電泳成功鑒定出Ifnar敲除鼠的基因型，與southern bolt鑒定法相比較，整個過程耗時較短、費用較低，該方法可以作為Ifnar基因敲除小鼠基因型檢測的一種快速可靠方法。

1994年Müller 等首次成功制成Ifnar敲除小鼠[8],屬于基因修飾的免疫缺陷小鼠模型。小鼠由于性格溫順易飼養，便于操作，繁殖能力強，且對病毒易感等特性，廣泛應用于各種病毒致病機理以及疫苗和藥物評價的研究。但是免疫功能健全的小鼠對有些病毒耐受,不能建立病毒感染模型或模型不利于后續病毒各項研究,免疫缺陷小鼠模型的建立就顯得尤為重要。例如，用寨卡病毒感染免疫功能健全的C57B/6,BALB/C,CD1小鼠，組織中未檢測到病毒RNA，小鼠也未出現疾病癥狀[9-11]。但Lazear等[12]用寨卡病毒接種Ifnar敲除小鼠，小鼠則高度易感，呈現后肢無力、癱瘓等典型的神經癥狀。因此，ifnar-/-免疫缺陷小鼠模型的建立和應用對某些特定病毒的研究至關重要。

目前，Ifnar敲除小鼠在人腸道病毒71 型(Enterovirus 71,EV71)[13-14]、登革熱病毒(Dengue virus，DENV)[15]和寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)[16]等的研究中都有應用。近年來，隨著zika病毒研究成為熱點問題，對于干擾素受體敲除小鼠的應用也隨之日益增加。但這些前期的研究中應用的干擾素受體敲除小鼠多為129背景,如 I型干擾素受體基因敲除的A129，II型干擾素受體基因敲除小鼠的G129，以及以上兩種鼠雜交得到的AG129。基因敲除小鼠常見于129小鼠是因為其ES做打靶時，中靶效率高，囊胚注射后成功率也高。最初Zika病毒研究中，小鼠模型也多為129背景,但近來B6背景的Ifnar敲除小鼠模型也多有建立[12，17]。因為B6小鼠遺傳背景和生理生化指標更清楚，當只有129背景品系小鼠時，可把129小鼠和B6小鼠回交，獲得B6類似背景的小鼠，再進行試驗。本實驗中小鼠為129小鼠和B6小鼠回交后得到的B6背景Ifnar敲除小鼠。

為滿足科學試驗研究的需要，本中心引進B6背景的ifnar基因敲除小鼠，在負壓屏障動物房飼養,通過一段時間的繁殖、鑒定，已獲得一定數量的ifnar基因敲除小鼠，這為多種病毒的深入研究提供了一定的前期實驗動物基礎，并且相較于129品系的小鼠模型，遺傳背景更清晰，生理生化指標更清楚，有助于得到重復性更好的實驗結果。