連續三代減數分裂雌核發育團頭魴的遺傳多樣性分析和RAPD鑒別方法的建立

唐首杰，畢 詳，張飛明，張友良

(1.上海海洋大學 農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306； 2.上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306； 3.上海海洋大學 水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306； 4.上海市松江區水產良種場，上海 201616)

人工雌核發育是一種有效的產生純系的手段，而且在魚類染色體操作、遺傳分析以及性別控制等方面具有潛在的應用價值。迄今為止，各國學者已先后在鯉科、鮭科、鰈科、鰍科和鯛科等近百種重要經濟魚類開展雌核發育研究并獲得成功[1-8]，在一些重要水生模式動物如青鳉和斑馬魚等也有諸多成功報道[9-10]。

團頭魴浦江1號是養殖性能優良的草食性魚類首例選育良種[11]，為使該良種的優良性狀基因進一步純化、鞏固和發展，自1999年以來，上海海洋大學水產種質資源研究室先后對團頭魴浦江1號選育系F5和F6進行了人工雌核發育(抑制第二次成熟分裂)的研究，成功地生產了一定數量的雌核發育魚(G1)[12]；隨后，他們又通過抑制一次雌核發育魚(G1)卵子的第二次成熟分裂成功地誘導出兩次雌核發育魚(G2)[13]，在G2的基礎上，用同樣的方法誘導得到連續3次減數分裂雌核發育魚(G3)。近幾年的養殖實踐證明，這些雌核發育團頭魴(G1、G2、G3)及其后代具有很好的生長優勢，其生長速度超過了團頭魴選育系。但在實際的育種過程中，不同雌核發育世代團頭魴群體的遺傳純合度的具體指標如何，是否能達到遺傳育種和遺傳分析所需要的純合度？此外，在雌核發育過程中可能由于經過輻射處理的異源精子的某些未失活遺傳物質、物理隔離的不完善等因素而影響雌核發育魚群體的遺傳純合性。因此，在將培育的雌核發育群體應用于育種實踐前，需要用各種技術在分子水平上對其基因組進行精確的遺傳學分析，以確定雌核發育類型魚類群體的遺傳純合度是否能達到遺傳育種的要求。另外，由于雌核發育團頭魴在形態上和普通團頭魴完全一致，從外形上無法鑒別普通團頭魴與雌核發育團頭魴(G1、G2、G3)，這導致這幾種魚(團頭魴浦江1號、G1、G2、G3)在養殖生產和選育過程中極易混雜，為下一步的純系選育工作埋下了隱患。鑒于此，采用分子遺傳標記技術分析不同雌核發育團頭魴群體的遺傳多樣性和遺傳純合度，進而尋找能夠有效區分不同團頭魴群體(團頭魴浦江1號、G1、G2、G3)的特異性分子標記已成為迫切需要解決的問題。

隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)是建立在聚合酶鏈式反應(PCR)基礎上的多位點DNA指紋技術，具有靈敏、快捷、簡便、費用少等特點。該技術自1990年被提出以來[14-15]，已被廣泛應用于魚類育種群體的遺傳多樣性分析[16]和品系鑒別[17]。賈海波等[18]采用RAPD技術分析了兩個人工雌核發育紅白錦鯉(Cyprinuscarpio)群體的遺傳多樣性。陳金輝等[19]采用RAPD技術評估了兩個不同人工雌核發育草魚(Ctenopharyngodonidellus)群體的遺傳多樣性和遺傳純合度。張桂蓉等[20]采用RAPD技術分析了兩個人工雌核發育系鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)近交F1群體的遺傳多樣性，驗證了雌核發育系后代的遺傳穩定性。在魚類遺傳育種實踐中，RAPD技術已成為育種群體鑒別的快速有效標記之一。鄒曙明等[12]通過RAPD分析發現了團頭魴選育系群體和雌核發育群體各自的特征性條帶。賈海波等[18]采用RAPD方法找到了7個引物的擴增譜帶可以作為區分兩個不同雌核發育錦鯉群體間的遺傳標記。陳金輝等[19]采用RAPD技術找到了連續兩代人工誘導雌核發育草魚群體和一代人工誘導雌核發育草魚群體間的特異性分子標記。司偉等[21]運用RAPD技術成功鑒別了建鯉雌核發育后代。

為評估不同雌核發育團頭魴群體(G1、G2、G3)的遺傳多樣性和遺傳純合度，鑒別不同團頭魴群體(團頭魴浦江1號、G1、G2、G3)，本研究以普通團頭魴(團頭魴浦江1號選育系F9)群體作為對照，利用RAPD技術對連續三代人工雌核發育團頭魴群體(G1、G2、G3)進行基因組掃描，目標有二，其一，確定不同雌核發育團頭魴群體的遺傳多樣性和遺傳純合度，進而從分子水平評估連續多代人工減數分裂雌核發育的效果；其二，尋找區分不同團頭魴育種群體(團頭魴浦江1號選育系F9、G1、G2、G3)的穩定的分子遺傳標記，建立團頭魴雌核發育群體的分子鑒別技術，為團頭魴雌核發育純系的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

對照組團頭魴選育系群體樣本為浦江1號選育系F9群體，試驗組為團頭魴一代雌核發育群體(G1)、團頭魴連續兩代雌核發育群體(G2)和團頭魴連續三代雌核發育群體(G3)，每群體各采集35尾，每尾剪取少許鰭條于95%乙醇中保存備用，所有樣本均采自上海海洋大學魚類種質研究試驗站(上海市浦東新區新場鎮)。RAPD隨機引物為10堿基引物，引物序號為S1～S100[編號同生工生物工程(上海)股份有限公司引物目錄]，共100個，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

基因組DNA提取采用常規的酚-氯仿方法進行[22]。

1.2.2 基因組DNA的RAPD分析

PCR擴增反應在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀上進行，每一樣品的反應總體積25 μL，含2.5 μL 10×擴增緩沖液，其中含100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 9.0)，500 mmol·L-1KCl，15 mmol·L-1MgCl2，1% (質量濃度)明膠，1%(體積分數)Triton X-100，最后調節pH值至8.0。2 μL dNTP混合液(每種dNTP的終濃度 0.2 mmol·L-1)，引物2 μL(終濃度0.2 μmol·L-1)，2 μL基因組DNA(50～150 ng)，0.5 μLTaqDNA聚合酶(1.25單位)，16 μL無菌重蒸水，最后加入30 μL石臘油。

PCR的擴增程序為：94 ℃預變性5 min，接下來進行45個循環，每個循環包括94 ℃ 45 s，36 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s；最后一次循環結束后在72℃延伸5min。

取10 μL擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓為5 V·cm-1，采用的分子質量標準為MarkerⅢ[天根生化科技(北京)有限公司產品]。電泳結束后，電泳凝膠經溴化乙錠染色，用Syngene凝膠成像分析系統進行掃描攝像，并用GeneTools軟件對每個RAPD隨機引物擴增條帶的分子質量進行估算。每個RAPD隨機引物至少被重擴一次以保證結果的準確性。

1.2.3 數據處理與分析

首先對照擴增圖譜分別統計RAPD特異性條帶在群體間的出現頻率。再進行遺傳多樣性數據統計，僅記錄清晰且重復性好的DNA條帶。根據MarkerⅢ各帶的遷移率確定擴增產物各帶的遷移率，同一引物對不同個體擴增出的RAPD條帶，只要遷移率相同都視為同一類型(性狀)記為1，缺乏此帶的記為0；以此類推，將所有個體的RAPD條帶轉換成二元數據矩陣。采用POPGENE1.31軟件包[23]計算以下遺傳變異參數：

多態位點比例(P)：P=(多態位點數/位點總數)×100%。

(1)

(2)

式(2)中：pi為某一座位上第i個等位基因在某一群體中出現的頻率；lnpi為pi的自然對數；r為等位基因數目。

群體內個體間Nei’s標準遺傳距離(Ds)和Nei’s遺傳相似系數(I)按照Nei[25]的方法計算：

Ds=-lnI；

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

式(3)～(7)中，Xij、Yij分別為個體X、Y第j座位第i個等位基因頻率；r為基因座數目；m為等位基因數目。

群體間Nei’s標準遺傳距離(Ds)和Nei’s遺傳相似系數(I)按照Nei[25]的方法計算：

Ds=-lnI；

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

式(8)～(12)中：Xij、Yij分別為群體X、Y第j座位第i個等位基因頻率；r為群體中的基因座數目；m為等位基因數目。

用Arlequin 3.01軟件[26]估測群體間成對FST值[27]，并利用置換檢驗法(permutation test)進行顯著性檢驗(重復次數為1 000)。

采用分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)估算各群體間和群體內的遺傳變異及分化水平。通過3種分子遺傳變量進行分析：FST為群體內個體之間(among individuals within populations)的遺傳變異；FSC為組內各群體間(among populations within groups)的變異程度；FCT為不同組別之間(among groups)的遺傳變異程度。并用置換檢驗法(permutation test)進行1 000次重復模擬計算，以上運算在Arlequin 3.01軟件[26]中完成。

利用MEGA 4.0軟件包[28]根據群體間Nei’s標準遺傳距離(DS)，用UPGMA法(unweighted pair group method with arithmetic means)和NJ法(neighbour-joining method)構建群體間聚類圖。

采用LSD-t檢驗比較群體間遺傳多樣性參數(多態位點比例和Shannon信息指數)，Bonferroni校正P值[29]，檢驗水準定為α=0.05，在SPSS 19.0 軟件上完成運算。

2 結果與分析

2.1 RAPD擴增結果

本研究從100條隨機引物中篩選出39條擴增條帶清晰、重復性好、擴增效果穩定的隨機引物(表1)，并對清晰可計數位點進行統計，各引物所產生的條帶數見表2。單條引物擴增的條帶數為2～10條，擴增片段長度集中在200～2 000 bp。39條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴增條帶總數分別為213條、202條、200條和190條，呈現出隨雌核發育世代數增加而減少的趨勢。單條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴增條帶數的范圍分別為2～10、2～9、2～9和2～10。

2.2 群體內遺傳變異分析

2.2.1 多態位點比例和Shannon信息指數

39條引物在F9、G1、G2和G3群體中的多態位點數、多態位點比例和Shannon信息指數見表2。39條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴增到的多態位點數分別為77、72、54和51，單條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴增到的多態位點數范圍分別為0～7、0～4、0～5和0～7。F9、G1、G2和G3群體的多態位點比例分別為36.15%、35.64%、27.00%和26.84%，F9群體的多態位點比例最高，G3群體的多態位點比例最低，3個雌核發育群體的多態位點比例均明顯低于對照組F9群體；隨著雌核發育世代數的增加，多態位點比例呈現逐代降低的趨勢，即G1>G2>G3。F9、G1、G2和G3群體的Shannon信息指數為0.138 3～0.207 9，F9群體的Shannon信息指數最高，G3群體的Shannon信息指數最低，3個雌核發育群體的Shannon信息指數均明顯低于對照組F9群體；Shannon信息指數隨雌核發育世代數的增加而降低，即：G1>G2>G3。

群體間多態位點比例和Shannon信息指數的LSD-t檢驗結果顯示(表3)，在α=0.05顯著性水平上，群體間多態位點比例差異不顯著(P=0.261～1.000)，群體間Shannon信息指數差異不顯著(P=0.312～1.000)。

總體而言，3個雌核發育群體的遺傳多樣性水平均明顯低于對照組F9群體，隨著雌核發育世代數的增加，遺傳多樣性水平呈現逐代降低的趨勢，即G1>G2>G3。

表1 本研究使用的39條RAPD引物序列及編號

Table 1 Sequences and codes of 39 random primers used in the study

引物編號Primer code序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)引物編號Primer code序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)引物編號Primer code序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)S1GTTTCGCTCCS29GGGTAACGCCS66GAACGGACTCS2TGATCCCTGGS30GTGATCGCAGS67GTCCCGACGAS3CATCCCCCTGS32TCGGCGATAGS68TGGACCGGTGS4GGACTGGAGTS33CAGCACCCACS69CTCACCGTCCS7GGTGACGCAGS38AGGTGACCGTS70AGGGCCGTCTS10CTGCTGGGACS40GTTGCGATCCS71AAAGCTGCGGS17AGGGAACGAGS45TGAGCGGACAS72TGTCATCCCCS19ACCCCCGAAGS50GGTCTACACCS73AAGCCTCGTCS21CAGGCCCTTCS51AGCGCCATTGS74GGATGAGACCS22TGCCGAGCTGS56AGGGCGTAAGS75GACGGATCAGS24AATCGGGCTGS58GAGAGCCAACS76CACACTCCAGS25AGGGGTCTTGS60ACCCGGTCACS77TTCCCCCCAGS28GTGACGTAGGS64CCGCATCTACS78TGAGTGGGTG

表2 四個群體的擴增位點數、多態位點數和Shannon信息指數(S)

Table 2 The number of amplified bands， polymorphic loci and Shannon’s information index (S) within four populations

引物Primer擴增位點數(多態位點數)Number of amplified bands (polymorphic loci)F9G1G2G3Shannon信息指數(S)Shannons information index (S)F9G1G2G3S15(2)5(1)5(2)4(1)0.16400.24930.18550.1289S24(3)3(0)3(0)3(0)0.00000.39760.00000.0000S36(1)4(1)4(1)4(0)0.09870.03780.09470.0000S44(1)4(1)4(3)4(2)0.16580.16580.49270.3116S74(1)4(2)4(1)3(0)0.17380.10780.13890.0000S105(2)5(1)6(3)4(0)0.13670.20780.33000.0000S177(1)7(3)7(0)7(0)0.37490.09470.00000.0000S193(0)2(1)2(0)2(0)0.34540.00000.00000.0000S215(0)5(0)6(1)6(3)0.00000.00000.11510.3229S225(0)5(2)5(0)5(0)0.25780.00000.00000.0000S2410(7)9(4)9(4)10(7)0.31570.40120.24110.4266S258(7)4(0)4(0)4(0)0.00000.40170.00000.0000S288(6)7(2)5(0)5(2)0.14660.36980.00000.1558S296(2)6(3)6(0)4(0)0.26660.20000.00000.0000S307(6)6(3)6(1)7(3)0.39470.50320.07940.2508S326(6)8(4)3(0)4(1)0.36270.43520.00000.1159S335(3)5(0)5(4)5(2)0.00000.41450.53050.2652S384(0)5(0)6(5)4(0)0.00000.00000.48610.0000S405(2)5(4)5(3)5(2)0.44110.21510.40340.3292S455(2)5(2)5(0)5(1)0.24000.26710.00000.1326S502(2)2(2)3(2)3(3)0.45130.45130.40630.6211S518(0)8(4)8(1)8(0)0.30470.00000.08290.0000S564(0)4(3)4(0)4(0)0.49500.00000.00000.0000S584(1)4(0)4(1)3(0)0.00000.16580.17270.0000S606(3)5(3)5(1)7(6)0.26620.22720.03780.4491S647(2)6(2)7(2)7(3)0.16580.13680.11590.2440S666(0)7(3)7(4)5(0)0.28740.00000.34040.0000S677(3)6(4)7(3)7(3)0.38420.23510.25500.2828S684(1)4(2)4(1)3(0)0.16400.05290.05290.0000S695(2)5(1)5(2)4(0)0.13910.27630.26710.0000S706(0)6(1)6(0)6(4)0.20000.00000.00000.4421S716(3)6(4)5(2)6(2)0.29510.31370.14370.2257S724(2)4(2)3(1)3(1)0.31160.31160.16110.1078S734(1)4(1)3(0)3(0)0.06610.17270.00000.0000S747(2)6(0)7(1)7(2)0.00000.19080.09210.1603S757(3)7(2)7(3)4(0)0.15360.23820.24840.0000S764(0)4(0)4(0)4(1)0.00000.00000.00000.1727S775(0)5(2)5(1)5(1)0.35330.00000.13260.1326S785(0)5(2)6(1)6(1)0.18520.00000.09260.1151 總計Total213(77)202(72)200(54)190(51) P/%36.1535.6427.0026.84 平均Mean0.20790.18570.14610.1383

2.2.2 群體內個體間的遺傳相似系數和遺傳距離

F9、G1、G2和G3群體內個體間的遺傳相似系數和遺傳距離見表4。4個群體的群體內個體間的平均遺傳相似系數為0.828 5～0.906 0，G3群體內個體間的平均遺傳相似系數最高(0.906 0)，F9群體內個體間的平均遺傳相似系數最低(0.828 5)，3個雌核發育群體的群體內個體間平均遺傳相似系數均明顯高于對照組F9群體；群體內個體間的平均遺傳相似系數呈現隨雌核發育世代數的增加而升高的趨勢，即G3>G2>G1。

表3 四個團頭魴群體間多態位點比例(對角線上)和Shannon信息指數(對角線下)LSD-t檢驗P值

Table 3P-values of LSD-ttests from percentage of polymorphic loci (above diagonal) and Shannon’s information index (below diagonal) between four populations ofM.amblycephala

群體PopulationF9G1G2G3F91.0000.9640.402G11.0000.6690.261G20.5061.0001.000G30.3121.0001.000

4個群體的群體內個體間的平均遺傳距離為0.099 1～0.190 8，G3群體內個體間的平均遺傳距離最低(0.099 1)，F9群體內個體間的平均遺傳距離最高(0.190 8)，3個雌核發育群體的群體內個體間平均遺傳距離均明顯低于對照組F9群體；群體內個體間的平均遺傳距離呈現隨雌核發育世代數的增加而降低的趨勢，即G1>G2>G3。

總體而言，3個雌核發育群體的遺傳純度(遺傳相似系數)均明顯高于對照組F9群體，隨著雌核發育世代數的增加，雌發育群體內的遺傳純度呈逐代上升的趨勢，即G3>G2>G1。

2.3 群體間遺傳變異分析

2.3.1 群體間RAPD特異片段分析

在39條擴增穩定、多態性豐富的隨機引物中，有5條引物在群體間產生了特異性DNA片段，這5條引物分別是S3、S40、S58、S71和S75(表5)。其中，引物S3擴增出一條長約136 bp片段，該片段在G3群體中出現頻率達100%，而在其他3個群體中的出現頻率均為0(圖1)；同時，引物S3擴增出另一條長約797 bp片段，該片段在G3群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體中的出現頻率均為100%(圖1)。由此可見，引物S3產生的RAPD圖譜及其特異片段(136 bp和797 bp)可以作為區分G3群體和其他3個群體(F9、G1和G2)的分子遺傳標記。

如圖2所示，引物S40擴增出一條長約780 bp片段，該片段在G3群體中的出現頻率為100%，而在其他3個群體中的出現頻率僅為5.71%～14.29%，筆者認為，該片段在G3群體中的高出現頻率可作為區分G3群體與其他3個群體(F9、G1和G2)的重要依據。

如圖3所示，引物S58擴增出一條長約439 bp片段，該片段在G3群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體(F9、G1和G2)中的出現頻率高達71.43%～100%，由此可以認為，引物S58產生的RAPD特異片段(439 bp)可作為區分G3群體和其他3個群體(F9、G1和G2)的分子遺傳標記。

如圖4所示，引物S71擴增出一條長約504 bp片段，該片段在G2群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體(F9、G1和G3)中的出現頻率高達71.43%～85.71%，因此，引物S71產生的RAPD特異片段(504 bp)可作為區分G2群體和其他3個群體(F9、G1和G3)的分子遺傳標記。

如圖5所示，引物S75擴增出一條長約313 bp片段，該片段在G3群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體(F9、G1和G2)中的出現頻率高達85.71%～100%，鑒于此，引物S75產生的RAPD特異片段(313 bp)可作為區分G3群體和其他3個群體(F9、G1和G2)的分子遺傳標記。

綜上所述，4條隨機引物(S3、S40、S58和S75)可用于區分G3群體和其他3個群體(F9、G1和G2)，其中，使用引物S3進行群體鑒別的可靠性最高。僅1條隨機引物(S71)能用于區分G2群體和其他3個群體(F9、G1和G3)。此外，目前尚未找到能有效區分F9群體和G1群體的隨機引物。

2.3.2 群體間遺傳相似系數、遺傳距離和遺傳分化

表4 群體內個體間的遺傳相似系數和遺傳距離

Table 4 Genetic identity and genetic distance between individuals within each population

數值Value遺傳相似系數Genetic identityF9G1G2G3遺傳距離Genetic distanceF9G1G2G3平均值Mean0.82850.85380.89680.90600.19080.15880.10930.0991最大值Maximum0.91150.92040.93810.94250.36430.22760.15270.1527最小值Minimum0.69470.79650.85840.85840.09270.08300.06390.0592

表5 五個引物在4個群體間擴增出的特異DNA片段及其出現頻率

Table 5 Size and frequencies of specific DNA fragments amplified by 5 random primers among four populations

引物Primer特異片段大小Specific fragment size/bp出現頻次(比率,%) Frequency (Percentage, %)F9G1G2G3S31360/35 (0)0/35 (0)0/35 (0)35/35 (100%)S379735/35(100%)35/35(100%)35/35(100%)0/35 (0)S407802/35 (5.71%)3/35 (8.57%)5/35 (14.29%)35/35 (100%)S5843930/35 (85.71%)35/35 (100%)25/35 (71.43%)0/35 (0)S7150430/35 (85.71%)25/35 (71.43%)0/35 (0)30/35 (85.71%)S7531335/35 (100%)35/35 (100%)30/35 (85.71%)0/35 (0)

M，MarkerⅢ；箭頭示特異DNA片段。下同。M， MarkerⅢ; The arrows showed the specific DNA fragment. The same as below.圖1 引物S3在4個群體中的擴增圖譜Fig.1 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S3

圖2 引物S40在4個群體中的擴增圖譜Fig.2 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S40

4個群體間遺傳相似系數和遺傳距離見表6。群體間遺傳相似系數為0.840 4～0.920 4，G1群體和G3群體間遺傳相似系數最低(0.840 4)，F9群體和G2群體間遺傳相似系數最高(0.920 4)。群體間遺傳距離為0.082 9～0.173 9，F9群體和G2群體間遺傳距離最小(0.082 9)，G1群體和G3群體間遺傳距離最大(0.173 9)。

4個群體間的遺傳分化指數(成對FST值)見表7。群體間成對FST值為0.269 2～0.419 5，F9群體和G2群體間FST值最小(0.269 2)，G2群體和G3群體間FST值最大(0.419 5)。經1 000次置換檢驗得到的FST值的P值為0.000 0～0.009 0，均達到極顯著水平(P<0.01)，據此可推測，4個群體間存在極顯著的遺傳分化。

2.3.3 分子方差分析

本研究對4個團頭魴群體進行分組(1個組、2個組、3個組)，從不同角度對群體遺傳變異進行分子方差分析(AMOVA)。結果顯示(表8)，在任何一種分組條件下，FST值都達到了極顯著水平(P<0.01)，說明群體內個體間的遺傳分化極顯著。當把所有群體分成2個組或3個組時，FSC值均達到極顯著水平(P<0.01)，表明群體間存在極顯著的遺傳分化。這證實了群體間遺傳分化指數(FST值)的分析結果。當把所有群體分成2個組或3個組時，在任何一種分組條件下，FCT值均未達到顯著水平(P>0.05)，表明組別之間不存在顯著的遺傳分化。

圖3 引物S58在4個群體中的擴增圖譜Fig.3 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S58

圖4 引物S71在4個群體中的擴增圖譜Fig.4 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S71

圖5 引物S75在4個群體中的擴增圖譜Fig.5 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S75

2.3.4 聚類分析

基于群體間Nei’s標準遺傳距離構建的4個團頭魴群體間NJ聚類圖和UPGMA聚類圖如圖6所示。因聚類方法的差異，2種聚類圖顯示了各自的特點，很難說哪種聚類圖最能反映真實的群體間遺傳關系。但2種聚類圖(圖6-a、b)均顯示，F9、G2和G3群體可被聚為一類，G1群體和其他3個群體(F9、G2、G3)間聚類關系較遠，這也驗證了前文中群體間遺傳距離的結果。

表6 四個群體間的遺傳相似系數(對角線上)和遺傳距離(對角線下)

Table 6 Genetic similarity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) between populations

群體PopulationF9G1G2G3F90.85820.92040.8920G10.15290.87490.8404G20.08290.13360.9037G30.11430.17390.1012

表7 四個群體間的遺傳分化指數(成對FST值)(對角線上)及其P值(對角線下)

Table 7 Genetic differentiation index (PairwiseFSTvalues) (above diagonal) and the probabilities of the test of genetic differentiation (below diagonal) between four populations

群體PopulationF9G1G2G3F90.28860.26920.3661G100.32850.4062G2000.4195G300.00900

表8 四個團頭魴群體間遺傳差異的分子方差分析(AMOVA)

Table 8 Analysis of molecular variance (AMOVA) among four populations ofM.amblycephala

分組Grouping變異百分率Percentage of variation/%群體內Withinpopulations組內群體間Among populationswithin groups組間Amonggroups固定指數Fixation indexFSTFSCFCT未分組One group65.2834.720.3472??2個組Two groups(1.F9;2.G1,G2,G3)67.8239.98-7.800.3218??0.3708??-0.0780ns2個組Two groups(1.F9,G1;2.G2,G3)65.1734.350.480.3483??0.3451??0.0048ns2個組Two groups(1.F9,G2;2.G1,G3)65.3835.10-0.480.3462??0.3493??-0.0048ns2個組Two groups(1.F9,G3;2.G1,G2)65.2834.720.000.3472??0.3472??0.0000ns2個組Two groups(1.F9,G1,G2;2.G3)62.3128.609.090.3769??0.3146??0.0909ns2個組Two groups(1.F9,G1,G3;2.G2)68.7641.91-10.680.3124??0.3787??-0.1068ns2個組Two groups(1.F9,G2,G3;2.G1)62.7329.477.800.3727??0.3196??0.0780ns3個組Three groups(1.F9;2.G1;3.G2,G3)65.1833.890.930.3482??0.3421??0.0093ns3個組Three groups(1.F9;2.G1,G2;3.G3)65.0833.111.810.3492??0.3372??0.0181ns3個組Three groups(1.F9;2.G1,G3;3.G2)67.1049.62-16.720.3290??0.4251??-0.1672ns3個組Three groups(1.F9,G1;2.G2;3.G3)65.3034.87-0.160.3470??0.3481??-0.0017ns3個組Three groups(1.F9,G2;2.G1;3.G3)63.6321.2615.100.3637??0.2504??0.1510ns3個組Three groups(1.F9,G3;2.G1;3.G2)65.4836.34-1.820.3452??0.3569??-0.0182ns

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ns表示“無顯著性”(P>0.05)。

* denotedP<0.05，**denotedP<0.01，ns denoted non-significant(P>0.05).

圖6 基于群體間遺傳距離的4個團頭魴群體間NJ聚類圖(a)和UPGMA聚類圖(b)Fig.6 NJ (a) and UPGMA (b) dendrogram of four populations of M. amblycephala based on genetic distances

3 討論

3.1 連續多代減數分裂雌核發育效果分析

在傳統的育種方法中，建立一個遺傳純系或選育系一般需要通過連續數代的近親交配來完成。同時還會因近交衰退及繁育條件限制對部分個體的淘汰造成育種材料的丟失，因而這是一項長期、大量而嚴密的工作[30]。而采用人工誘導雌核發育的方法可大大地加速純化過程。人工誘導魚類雌核發育的方式有兩種：一種是通過抑制第二極體釋放來誘導產生雌核發育二倍體，稱為減數分裂雌核發育；另一種是通過抑制第一次卵裂來誘導產生雌核發育二倍體，稱為卵裂雌核發育[30]。一次卵裂雌核發育相當于8～10代同胞兄妹交配，一次卵裂雌核發育加一次減數分裂雌核發育就可以獲得純系[10]。據吳清江等[1]報道，鯉(CyprinuscarpioL.)雌核發育第一代近交系數已接近60%，2～3代雌核發育可取代鯉8～10代近交。

理論上，抑制第二極體釋放誘導雌核發育二倍體時，如果不發生重組，子代都應成為完全的純合體，但由于魚類的染色體一般都發生一次交叉，因此距離著絲粒近的基因位點為純合體，距離著絲粒遠的基因位點，雜合體的比率根據基因位點在染色體上的位置而變化，范圍為0～1.0。在實際的雌核發育育種實踐中，連續多代誘導減數分裂雌核發育，將快速地提高遺傳相似系數。雖然是雜合子，但是親本的遺傳特征已被固定，其子代個體數量性狀表現一致，個體之間差異較小，可以作為良種選育的一種有效方法。許多研究顯示，人工誘導多代減數雌核發育將大大加速魚類基因純合速度[31-33]，例如，大黃魚連續兩代減數雌核發育群體15個微衛星座位的平均純合度高達0.803，群體內個體間平均相似系數達0.867 2[31]。牙鲆連續兩代減數分裂雌核發育群體內個體間的平均遺傳相似系數為0.923 8，顯著高于對照組家系，證明連續多代人工誘導減數分裂雌核發育具有固定母本遺傳性狀的作用[32]。鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)連續兩代減數分裂雌核發育群體內個體間平均遺傳相似度達0.980 7，達到了快速建立純系的目的[33]。

團頭魴浦江1號是原農業部公告推廣的魚類良種，目前已成為我國團頭魴養殖業的主導品種之一，鑒于沒有永遠的良種的理念和推陳出新的時代要求，借助人工雌核發育技術，在浦江1號良種的基礎上，快速培育出性狀更加優良且遺傳穩定的品系具有十分重要的意義。上海海洋大學水產種質資源研究室早在2000年就成功開展了團頭魴減數分裂雌核發育的誘導，并陸續獲得了第一代減數分裂雌核發育群體和連續兩代減數分裂雌核發育群體[12-13]。為使團頭魴雌核發育家系的遺傳純合度得到更顯著的提升，本課題組對連續兩代雌核發育團頭魴雌魚卵子再進行減數分裂雌核發育誘導，成功培育出連續三代減數分裂雌核發育團頭魴群體，并應用于良種選育實踐。本研究采用39條隨機引物對雌核發育一代群體(G1)、雌核發育二代群體(G2)和雌核發育三代群體(G3)基因組進行RAPD分析，結果顯示，G1、G2和G3群體的多態位點比例分別為35.64%、27.00%和26.84%，遠低于鯉(C.carpioL.)[20]、雙棘黃姑魚(Nibeadiacanthus)[34]和唐魚(TanichthysalbonubesLin)[35]等魚類養殖群體的相應參數。而且，多態位點比例隨雌核發育世代數的增加而降低，即：G1>G2>G3，其中，G2比G1降低了24.24%，G3又比G2降低了0.59%，平均每代降低12.42%。G1、G2和G3群體的Shannon信息指數分別為0.1857、0.1461和0.1383，遠低于鯉(C.carpioL.)[20]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[19]和雙棘黃姑魚(Nibeadiacanthus)[34]等魚類養殖群體的相應參數。而且，Shannon信息指數隨雌核發育世代數的增加而降低，即：G1>G2>G3，其中，G2比G1降低了21.32%，G3又比G2降低了5.34%，平均每代降低13.33%。多態位點比例和Shannon信息指數的結果一致表明，連續多代的人工減數分裂雌核發育誘導已使團頭魴育種群體的遺傳多樣性明顯降低，并呈現逐代降低的趨勢。G1、G2和G3群體內個體間的平均遺傳相似系數分別為0.853 8、0.896 8和0.906 0，呈現隨雌核發育世代數的增加而升高的趨勢，即：G3>G2>G1，其中，G2比G1升高了5.04%，G3又比G2升高了1.03%，平均每代升高3.04%。表明連續多代的人工減數分裂雌核發育誘導已使團頭魴育種群體的遺傳純度明顯升高，并呈現逐代升高的趨勢。以上結果表明，連續多代減數分裂雌核發育能顯著加快團頭魴基因的純合速度，使控制優良性狀的基因快速純合化；所培育的雌核發育群體，尤其是雌核發育三代群體已經是一個遺傳一致性較高的高純品系。此外，G3群體與對照組(F9群體) 間成對FST值為0.366 1，經1 000次置換檢驗得到的FST值的P值為0.000 0，已達到極顯著水平(P<0.01)，顯示G3群體與對照組(F9群體)間已經發生了極顯著的遺傳分化。這也說明連續的雌核發育是快速建立具有特定遺傳特征品系的有效途徑，這在以往的研究報道[36-38]中已得到印證。本研究結果為連續多代人工誘導減數分裂雌核發育育種實踐提供了新的依據。

3.2 群體間鑒別標記的發現及其成因分析

人工誘導雌核發育是使團頭魴良種重要經濟性狀基因快速純化和固定的主要途徑。但在實際的雌核發育育種實踐中，因雌核發育子代與普通團頭魴在形態上極其相似，故使用傳統的形態學方法難以準確區分雌核發育團頭魴與普通團頭魴群體。作為一種高效的分子遺傳標記技術，RAPD技術標記位點多，理論上，其檢測區幾乎覆蓋整個基因組，已成為魚類品種(系)鑒定和遺傳多樣性分析的有力工具。例如，劉敏等[39]從100條RAPD隨機引物的擴增圖譜中找到了7條能區分雌核發育草魚與普通草魚群體的特異性條帶。賈海波等[18]從30個RAPD隨機引物中找到7個引物的擴增譜帶用于鑒別兩個不同的紅白錦鯉雌核發育群體。

本研究從100條RAPD隨機引物中篩選到5條在群體間產生特異DNA片段的引物，根據這些引物擴增到的特異DNA片段在群體內的出現頻率，可以將它們分成兩類，第一類特異DNA片段在某個雌核發育群體中出現頻率為0，在對照組和其他雌核發育群體中出現頻率很高(71.43%～100%)。如引物S3擴增出的一條長約797 bp片段在G3群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體中的出現頻率均為100%(圖1)。引物S58擴增出的一條長約439 bp片段在G3群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體(F9、G1和G2)中的出現頻率高達71.43%～100%(圖3)。引物S71擴增出的一條長約504 bp片段在G2群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體(F9、G1和G3)中的出現頻率高達71.43%～85.71%(圖4)。引物S75擴增出的一條長約313 bp片段在G3群體中的出現頻率為0，而在其他3個群體(F9、G1和G2)中的出現頻率高達85.71%～100%(圖5)。第二類特異DNA片段在某個雌核發育群體中出現頻率為100%，而在對照組和其他雌核發育群體中出現頻率很低(0～14.29%)。如，引物S3擴增出的一條長約136 bp片段在G3群體中出現頻率達100%，而在其他3個群體中的出現頻率均為0(圖1)；引物S40擴增出的一條長約780 bp片段在G3群體中的出現頻率為100%，而在其他3個群體中的出現頻率僅為5.71%～14.29%(圖2)。

在人工誘導雌核發育的過程中，盡管因自然因素和人為因素的作用，也可能誘發突變，但雌核發育誘導本身并不能產生新的基因，而是通過等位基因頻率的變化，使一些有利的性狀得以積累和加強，一些有害隱性基因控制的性狀也會因基因座位的純合化而表達出來，從而被淘汰。產生第一類特異DNA片段的原因，可能是雌核發育團頭魴群體近交水平和遺傳純度較高，各等位基因在一定程度上被固定，因而頻率上升，譜帶數目減少。此種現象已在多種魚類雌核發育群體中被觀察到，劉敏等[39]從100條RAPD隨機引物的擴增圖譜中找到了7條能區分雌核發育草魚與普通草魚群體的特異性條帶，其中6條僅存在于普通草魚中，在異精雌核發育草魚F1中缺失。張虹[40]從180條RAPD隨機引物中篩選到一個引物(S68)作為鑒別雌核發育草魚和普通草魚的分子標記，該引物在普通草魚群體中擴增到一條1 311 bp條帶，而在雌核發育草魚群體中未擴增到相應條帶。

第二類特異DNA片段的出現違背了雌核發育過程中遺傳物質缺失的普遍規律，筆者認為可能有以下兩個方面的原因：第一，可能是“異精效應”結果[41]，一般認為，雌核發育子代沒有出現父本的遺傳物質[42]，但也有大量研究表明雌核發育子代中整合了部分父本遺傳信息。鄒桂偉等[43]采用44條RAPD隨機引物對連續兩代雌核發育鰱、雄鯉和普通鰱進行RAPD分析后發現，有10條引物出現了雌核發育鰱與父本(雄鯉)相同的DNA片段，而野生長江鰱(親本鰱)則沒有，表明雌核發育鰱基因組DNA可能帶有父本基因組DNA的特性。張海發等[44]對異精激發的彭澤鯽雌核發育子一代及其雙親進行RAPD分析后發現，異育彭澤鯽子一代中含有少數與父本相同而與母本相異的特異條帶，表明彭澤鯽已不再是完全的母性遺傳，異育彭澤鯽基因組DNA中可能帶有部分異源父本基因組DNA的特性。本研究中第二類特異DNA片段的出現是否為“異精效應”作用的結果還有待通過進一步研究其與父母本的遺傳關系來證實。第二，第二類特異DNA片段的出現可能與雌核發育團頭魴的原始母本來源有關，G1群體的母本為團頭魴浦江1號選育系F6，G2群體由G1群體中的雌魚誘導而來，G3群體由G2群體中的雌魚誘導產生，因此，雌核發育團頭魴的母本為團頭魴浦江1號選育系F6的部分個體。而F9群體是以團頭魴浦江1號選育系F6為基礎，再經連續3代人工選育而來，由此可知，F9群體與3個雌核發育群體(G1、G2、G3)有著相似的親本來源，但在實際育種過程中，也可能因某些因素(如，繁育群體的非隨機交配、遺傳漂變等)的影響而導致基因重組進而產生新的遺傳變異，但這還有待進一步的研究確認。