復方樟柳堿對大鼠缺血微動脈血流灌注和自律運動的影響*

張 堅 楊明峰 劉明明 李 媛 孫保亮, #

樟柳堿是從茄科植物唐古特山莨菪根中提取的一種生物堿，為膽堿能神經阻滯劑，具有緩解平滑肌痙攣的抗膽堿作用，現已實現化學合成，其對恢復微循環灌注、改善局部組織缺血、提升微血管活性、緩解微血管痙攣、保護和穩定微血管內皮細胞等方面的功效明確[1]。復方樟柳堿(Compound Anisodine，CA)為氫溴酸樟柳堿(703)和普魯卡因(PHI)的復合制劑，可改善多種原因所致的視網膜、脈絡膜和視神經部位的微循環血液灌注障礙，有助于治療青光眼視神經病變、視網膜動靜脈阻塞和視神經挫傷等疾病，已廣泛應用于治療缺血性眼病，其功效機理以改善缺血組織微循環血流灌注為基礎[2-4]，達到比單純擴血管藥物更佳的療效[5]，但改善血流灌注的作用機制尚未闡明。

微血管自律運動是微血管持續呈現的自主節律性收縮與舒張，并由此引起局部微循環血流灌注的節律性波動，有助于促進微循環灌注效率、促進物質交換與代謝，具有重要生理意義[6-9]。組織缺血初期微血管自律運動激活可代償性增加組織微循環灌注能力[10]，若缺血狀態持續，自律運動會受到抑制，組織缺血可能進一步加重。應用莨菪類藥物可以激活微血管自律運動，改善組織微循環血流灌注狀態[11]。因此，激活微血管自律運動對加強組織微循環血流灌注、改善組織缺血狀態意義顯著。本研究通過活體動物微動脈反應性實驗模型，探討CA及其組分703(0.01%)和PHI(0.1%)對大鼠小腸壁微動脈血流灌注和自律運動的影響，為CA臨床作用機理提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

SPF級雄性SD大鼠，體質量233.2±19.2g，共66只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號SCXX [京] 2012-0001，批號：1140070094792)。經1周適應性喂養，按實驗時所用藥物，采用隨機數字表法分為CA組、703組和PHI組，每組18只，余12只用作生理鹽水(NS)對照組(NS組)。各組大鼠飼養于12h明暗交替環境，溫度22-23℃，濕度40%- 60%，自由飲水攝食。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1試劑：重酒石酸去甲腎上腺素(NE)注射液購自上海禾豐制藥有限公司(規格2mg/ml，批號：131003)，配制應用濃度為0.02%；CA注射液購自北京紫竹藥業有限公司(規格2ml，含703 0.2mg、pHI 20mg，批號：14130906)，應用濃度為注射液原液；703粉劑購自北京紫竹藥業有限公司(批號：1420140303)，配制應用濃度為0.01%；PHI注射液購自東亞制藥有限公司(規格0.1ml，濃度1%，批號：2014091761)，配制應用濃度為0.1%；NS購自山東齊都藥業有限公司，使用濃度為0.9%。所有試劑配制均使用雙蒸水。

1.2.2儀器：Nikon體視顯微鏡(AZ100型，日本Nikon公司)；三維可調節光纖冷光源照明裝置(C-FLED2型，日本Nikon公司)；激光多普勒微循環血流儀(LDF PF5000型，光纖探頭200μm，瑞典Perimed公司)；自動微量注射泵(KDS-100-CE型，美國KD Scientific公司)；PVC輸液管(200μm)與光纖探頭組合為一體，安裝于三維可調節夾持裝置，確保滴液定位準確；自制小腸保濕恒溫裝置。

1.3 大鼠小腸壁微動脈顯微觀測方法

各組大鼠經3 %戊巴比妥鈉麻醉后，于下腹部中線右側切口，暴露小腸段，置于保濕恒溫實驗裝置內，在體視顯微鏡下通過三維調節夾持裝置將LDF光纖探頭和PVC輸液管組合垂直定位于小腸外壁單支微動脈(平均管徑95±21μm)，保證給藥、檢測的精準定位控制。

所有藥物通過輸液泵滴加單支微動脈，滴加量均為0.1ml，藥物影響范圍≤5mm2。先行滴加NE 0.1ml致微動脈完全收縮，隨后立即滴加各種干預藥物。連續記錄NE前、各種藥物干預后即刻至15min的微動脈血流灌注和自律運動數據曲線，選擇讀取NE前、藥后即刻、1min、5min、10min、15min 6個時點數據進行統計學分析。

1.4 檢測指標

將各組NE前平穩時10s血流量均值設為均一化基準值，觀察記錄各組各時點微動脈血流灌注和自律運動的變化水平。其中血流灌注指標包括血流灌注水平(BP)、相對血流灌注水平[RBP=(藥后不同時點BP/NE前BP基準值)×100]；自律運動指標包括藥后自律運動起始時間(Vt)，應用快速傅里葉變換法(FFT)[12]計算藥后15min內微動脈自律運動頻率(VF)和振幅(VA)。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠微動脈RBP比較

應用NE預收縮前，各組BP的基線值未見明顯差別(P>0.05)；滴加NE后，各組微動脈血流均停滯。局部滴加不同實驗藥物后不同時間，各組BP開始不同程度恢復，如圖1所示。據此計算分析各組藥后RBP時效，結果表明藥后即刻、1min、5min、15min的RBP水平經方差分析有顯著性差異(均P<0.05)，各組藥后10min的RBP無統計學意義(P>0.05)。兩兩比較，藥后即刻RBP以703組最高，與NS組接近(P>0.05)，PHI組最低；藥后1min和5min的RBP以CA組最高，幾近NE前水平(P>0.05)，顯著高于其它三組(均P<0.01)，PHI組次之，也明顯高于703組和NS組(均P<0.01)；藥后15min的RBP仍以CA組最高，與其它三組有顯著差異(均P<0.05)，703組次之，PHI組最低。見表1和圖2。

2.2 各組大鼠微血管自律運動指標比較

應用NE可致微動脈預收縮，造成局部微循環停滯，但伴行的微靜脈未見同步收縮反應。給予實驗藥物干預，在微血流恢復中，藥物作用可誘發檢測點原位或其上游微動脈出現不同程度的自律運動，引起檢測點微血流灌注量節律性波動。

圖1 各組大鼠微動脈藥物干預前后BP變化曲線

組 別nNE前藥后即刻藥后1min藥后5min藥后10min藥后15minNS組12100.00±0.0017.37±5.1617.37±4.2426.37±10.5664.64±28.5078.80±24.89CA組18100.00±0.0015.15±3.711)71.89±20.632)96.60±19.672)85.36±22.4191.50±18.541)703組18100.00±0.0018.33±5.253)21.74±6.653)24.95±7.843)82.02±19.9283.65±21.153)PHI組18100.00±0.0011.23±2.104)44.15±18.214)78.34±19.814)76.02±20.3565.97±23.844)F值8.8937.7061.571.573.32

注：與703組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與PHI組比較，3)P<0.01；與NS組比較，4)P<0.01

圖2 各組大鼠微動脈藥物干預前后RBP的時效曲線

如表2所示，各組間數據方差分析VF無統計學差異(P>0.05)，Vt和VA具有統計學意義(均P<0.05)。兩兩比較703組Vt出現最早，CA組次之，均明顯早于PHI組和NS組(P<0.05或P<0.01)；CA組VA顯著高于其它三組(P<0.01)，PHI組大于703組和NS組(均P<0.01)，703組與NS組差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組微動脈自律運動指標比較

注：與703組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與PHI組比較，3)P<0.01；與NS組比較，4)P<0.01

3 討 論

既往研究表明，山莨菪堿能夠激活微血管自律運動[11]，改善組織血流灌注。本研究顯示，CA可使大鼠微動脈相對血流灌注水平回升至NE前，明顯強于其組分703和PHI的單獨作用。提示CA對于NE所致微動脈收縮，有快速擴張微動脈恢復血流灌注的功效。

微血管自律運動是微循環血流灌注調控的動態模式，由小動脈、微動脈和毛細血管前括約肌等的自主節律性舒縮，并引起組織微循環血流及壓力的節律性波動而成，可使毛細血管床血液充盈和排空呈現交替變化[7]，有助于提高組織血流灌注水平，促進微循環物質交換和氧代謝[7, 13, 14]。自律運動根據其頻率和振幅可分為三種基本有效模式，即低頻高幅、高頻高幅、高頻低幅，其中低頻高幅模式能效最大、持久性最強，對血流灌注和物質交換貢獻最顯著[15, 16]，而低頻低幅模式屬于無效噪音模式。本文顯示，VF各組間無顯著差異，均為低頻模式；CA組Vt較早，VA最高，符合低頻高幅模式的微血管自律運動，可快速激活微動脈，快速提升微循環血流灌注水平；703組的Vt雖早于CA組，但其VA很低，相對CA組，可認為其微血管自律運動的表現為低幅模式，對改善血流灌注貢獻明顯不如CA；PHI組Vt較慢，VA雖相對較高，但明顯低于CA組，有較強的擴血管、增血流效果，但無法形成穩定高效的微血管自律運動，因此改善組織微循環灌注的能力有限；NS組為低頻低幅模式，且Vt也晚，故對血流灌注的改善幾乎無作用。說明CA可發揮703和PHI的協同作用，激活微血管自律運動低頻高幅模式，產生高效改善組織缺血的效果，充分體現了CA的優越性。

微血管自律運動受神經體液調節，與組織代謝狀態和組織血氧變化密切相關[17, 18]。自律運動的波浪樣節奏，較穩態血流更能顯著提高毛細血管床的血流灌注和跨血管壁物質交換的效率，增強組織氧代謝和氧擴散距離以及促進氧濃度均勻分布，這種特殊的血流動能還有助于防止血栓形成、減少白細胞貼壁，改善微循環血流狀態、緩解局部血流瘀滯[19, 20]，解除血管痙攣，改善血液黏稠度[5]，從而更有效提升血流動能和灌注效率。

綜上，CA能明顯改善NE致大鼠腸壁微動脈缺血，干預機理在于其激活了微動脈自律運動的低頻高幅模式。CA的組方配伍，在發揮PHI解痙和擴血管作用的同時，利用703激活微血管自律運動功效，協同改善組織血流灌注和微循環功能。本研究為全面闡明臨床實踐中CA的治療作用提供了初步實驗依據。