谷子種子線蟲檢測及分析

宋振君，李志勇，王永芳，全建章，馬繼芳，白 輝，董志平

(1.河北省農林科學院 谷子研究所，河北省雜糧重點實驗室，國家谷子改良中心，河北 石家莊 050035；2.河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024)

谷子(Setariaitalica)起源于中國，具有悠久的種植歷史。谷子是一種抗旱耐瘠、糧草兼用、富含營養的特色雜糧作物，可用于提升干旱地區糧食產量、發展畜牧業和改善人們膳食結構[1-2]。谷子線蟲病是華北谷子產區的重要病害，在河北中南部、山東、河南等夏谷區普遍發生，嚴重地塊可減產50%～80%，是當前谷子高產穩產的主要障礙之一[3]。由于谷子種子調運頻繁、抗病品種培育困難、主要栽培品種均為感病品種等因素影響，在我國谷子產區谷子線蟲病蔓延的趨勢日益加劇[4]。谷子線蟲病又稱紫穗病或者倒青，病原菌為貝西滑刃線蟲(AphelenchoidesbesseyiChristie, 1942)，是一種遷移性植物寄生線蟲[5]。谷子線蟲病的傳播主要依賴于帶病種子，線蟲會伴隨著植株的生長逐漸由植株的地下部分轉移到地上部分，主要為害花器、子房，影響穗的發育，造成谷子大量減產[3, 6]。

谷子線蟲為種傳病害，應從選種初期進行篩選與防控，切斷傳播病害的源頭，因此對種子進行帶線蟲檢測尤為重要。崔麗麗等[7]采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板法和紙培養法，檢測到吉林省北五味子種子攜帶有青霉屬、曲霉屬和根霉屬病菌；趙芝等[8]對采自云南省的15份三七種子樣品，采用PDA平板法檢測到種子表面和內部攜帶多種真菌；胡曉芬等[9]采用盆栽幼苗癥狀觀察法和PDA培養基法，對7個玉米品種進行了種子表面帶菌檢測，結果檢測到供試種子表面攜帶有4種真菌；高葦等[10]用洗滌法和PDA平板法，對12個黃瓜栽培品種進行種子外部和內部帶菌檢測，結果顯示供試種子外部帶菌量高于種子內部寄藏真菌；金柳艷等[11]對黃淮海夏玉米區720個玉米籽粒樣品帶菌量進行檢測，采用洗滌檢測法和PDA平板檢測法，發現表面無癥狀的玉米籽粒在成熟期均攜帶大量病原菌。目前，關于種子帶菌檢測的報道中很多試驗者都采用PDA平板法[12]對籽粒的帶菌率與分離到菌屬的分離頻率進行統計，且對分離得到的菌屬進行分類鑒定。此檢測方法在平板培養過程中易受雜菌的干擾，且鑒定結果還需要進行再接種的生物學試驗進一步確定，如有大量的樣品需要檢測時，耗時費力[13]。

由于滑刃屬線蟲種類繁多，形態特征復雜多變，且與其近似種十分相似，利用傳統方法對貝西滑刃線蟲進行形態學鑒定，需要扎實的分類鑒定功底，因此，傳統檢測方法有一定的局限性。隨著分子生物學技術的快速的發展，基于PCR技術的分子檢測技術以其特異性強、靈敏度高、檢測快速、簡捷且鑒定結果準確等優勢，已被用于種子中植物病原菌的檢測[13-21]。宋順華等[13]通過優化PCR模板的方法，利用傳統的PCR技術，檢測出西瓜種子帶有細菌性果腐病菌；任毓忠等[22]采用特異性引物PCR技術檢測出8個市售哈密瓜品種的種子攜帶有瓜類果斑病菌；曾丹丹等[23]采用環介導等溫擴增技術對黃淮地區29個大豆主栽品種種子進行帶菌檢測，檢測出多種病原菌；張貴等[24]利用巢氏聚合酶鏈式反應，檢測出向日葵種皮中攜帶有黃萎病菌。在種子帶菌檢測中PCR的方法呈現出快速、簡捷且鑒定結果可靠的優點，因此可用于谷子種子帶菌的檢測。在谷子中利用PCR技術檢測種子攜帶線蟲的報道還極少。因此，本研究以來自黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山東、山西和陜西等谷子主產區的99份谷子種子DNA為模板，使用已報道的1對貝西滑刃線蟲PCR特異性引物進行PCR擴增[21]，快速檢測谷子種子是否帶有貝西滑刃線蟲，并分析線蟲種群的單倍型數目和變異位點，旨在為谷子種子攜帶線蟲進行快速鑒定提供技術支持，為谷子線蟲病的早期診斷與防控奠定理論基礎。

1 材料和方法

試驗于2018年4-8月在河北省農林科學院谷子研究所河北省雜糧重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

供試的谷子線蟲病穗，由河北省農林科學院谷子研究所植保室保存；99份谷子種子來自黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山東、山西和陜西等國家谷子高粱產業體系育種崗位、試驗站和種子公司，具體信息詳見表1。

表1 99份供試谷子品種編號及來源Tab.1 Numbers and origins of the 99 tested foxtail millet varieties

1.2 試驗方法

1.2.1 谷子種子基因組DNA的提取 使用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP321-03)提取谷子種子基因組DNA，試驗步驟參照試劑盒說明書。分別采用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop方法檢測DNA樣品的完整性、純度和濃度，選擇合格的DNA樣品進行PCR擴增。

1.2.2 引物的特異性檢測 采用已報道的根據貝西滑刃線蟲核糖體28S rRNA-D2/D3片段設計的特異性引物[21]：GU-F(GACACTGCAATCGCTTCGAC)/GU-R(ATCCGCAACCACAACTCACA)，以谷子貝西滑刃線蟲和其他4種谷子籽粒上常見的病原菌：谷子銹菌(Uromycessetariae-italicae)、谷瘟病菌(Pyriculariasetariae)、白發病菌(Sclerosporagraminicola)和粟粒黑穗病菌(Ustilagocrameri)DNA為模板進行PCR擴增，檢測引物的特異性。PCR反應體系為25 μL，2 × Es Taq Master Mix 12.5 μL(北京康為世紀生物科技有限公司，CW0690)、模板DNA 2.0 μL、上下游引物各1 μL(濃度10 μmol/L)、超純水補足。PCR擴增程序：94 ℃預變性 2 min；35個循環反應(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。電泳緩沖液為1×TAE，恒定電壓160 V，電泳20 min，用EB染色并在紫外凝膠成像儀上觀察電泳條帶并且拍照。

1.2.3 引物的靈敏度檢測 將谷子線蟲DNA用滅菌超純水稀釋為初始質量濃度10 ng/μL，按(1，1/10，1/20， 1/40，1/80，1/160)共6個濃度梯度，分別稀釋成10.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.062 5 ng/μL。以不同濃度的DNA為模板，采用PCR檢測體系進行擴增，檢測特異性引物的靈敏度。

1.2.4 28S核糖體RNA序列PCR擴增和測序 利用貝西滑刃線蟲特異性引物GU-F/GU-R對谷子種子基因組DNA進行PCR擴增，總反應體系為25 μL，反應程序：94 ℃預變性 2 min；35個循環反應(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s)，72 ℃延伸5 min。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的條帶。按照凝膠DNA小量回收試劑盒(美基生物科技有限公司，D2111-03)的步驟將切膠回收的目的片段與pMD19-T載體連接，將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞(DH5α)，把經菌落PCR篩選的陽性克隆菌液送至上海生工測序。每個樣品測序3次，3次測序結果吻合的樣品進行數據分析。利用Sequencher_v4.1.4 軟件讀取測序的序列，觀察峰值進行反復校對，利用DNAMAN_v6、ClustalX1.81[25]軟件對測得的序列進行分析，并與從GenBank上下載貝西滑刃線蟲28S核糖體RNA序列進行多序列同源比對，分析單倍型數目和變異位點。

2 結果與分析

2.1 引物的特異性檢測

利用谷子貝西滑刃線蟲的特異性引物GU-F/GU-R，以谷子貝西滑刃線蟲和4種谷子籽粒上常見的病原菌(谷銹菌、谷瘟病菌、白發病菌和粟粒黑穗病菌)DNA為模板進行PCR擴增，以驗證引物的特異性。結果如圖1所示，該引物僅能對谷子貝西滑刃線蟲DNA擴增出約245 bp的特異性片段，其他病原菌DNA與陰性對照(ddH2O)則無條帶出現。將特異性片段進行回收純化和測序，與GenBank數據庫中貝西滑刃線蟲的28S核糖體RNA序列(登錄號：KX622689.1)進行比對分析，可知245 bp特異性片段的序列與貝西滑刃線蟲序列完全匹配，說明引物GU-F/GU-R能夠特異的檢測出谷子貝西滑刃線蟲。

M.Marker；AB.谷子貝西滑刃線蟲；US.谷銹菌；PS.谷瘟病菌；SG.白發病菌；UC.粟粒黑穗病菌；CK.陰性對照(ddH2O)。

M.Marker；AB.Aphelenchoidesbesseyi；US.Uromycessetariae-italicae；PS.Pyriculariasetariae；SG.Sclerosporagraminicola；UC.Ustilagocrameri；CK.Negative control(ddH2O).

圖1 貝西滑刃線蟲特異性引物GU-F/R的檢測結果
Fig.1 Detection results ofAphelenchoidesbesseyispecific primerGU-F/R

2.2 引物的靈敏度檢測

利用谷子貝西滑刃線蟲的特異性引物，以谷子線蟲DNA稀釋后不同質量濃度的DNA(10.0, 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625ng/μL)為模板進行PCR擴增，以檢測特異性引物的靈敏度。結果如圖2，模板濃度為10 ng/μL時，擴增條帶清晰且明亮。質量濃度為1 ng/μL(1/10×)和0.5 ng/μL(1/20×)時，擴增條帶依然清晰可見。稀釋至0.125 ng/μL(1/80×)時，條帶亮度下降，但仍可判別。質量濃度為0.062 5 ng/μL(1/160×)時，特異性條帶基本消失。表明貝西滑刃線蟲特異性引物對線蟲DNA檢測靈敏度較高，即使DNA濃度較低時，仍保持較高的檢測效率。線蟲DNA模板量為0.125 ng/μL是引物的最低檢測濃度。

M.Marker；1-6.(1×，1/10×，1/20×，1/40×，1/80×，1/160×)；CK.陰性對照(ddH2O)。M.Marker；1-6.(1×，1/10×，1/20×，1/40×，1/80×，1/160×)；CK. Negative control(ddH2O).

M.Marker；CK+.貝西滑刃線蟲；CK-.ddH2O；C1～C99.品種編號。M.Marker；CK+. Aphelenchoides besseyi；CK-.ddH2O；C1-C99.Cultivar numbers.

2.3 谷子種子攜帶貝西滑刃線蟲及其頻率的檢測

將采自黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山東、山西和陜西等地的99份谷子種子樣本進行基因組DNA提取，利用PCR技術，對籽粒上的貝西滑刃線蟲進行擴增檢測。結果如圖3所示，99份種子樣品中有33份擴增出特異性條帶，陰性對照(ddH2O)無條帶。對擴增條帶進行TA克隆并選擇陽性克隆進行測序。將測序結果與貝西滑刃線蟲28S核糖體RNA序列(KX622689.1)進行比對，除C40樣品的序列為97%以外，其他所有序列與其相似性為99%及以上。結果表明，本研究建立的PCR體系具有良好的準確性與穩定性，可用于谷子種子中貝西滑刃線蟲的檢測。

表2 不同地區谷子品種種子帶病頻率的檢測結果Tab.2 Contamination rate of different foxtail millet cultivars detected

為了確定谷子不同品種籽粒攜帶貝西滑刃線蟲的頻率，對99份谷子種子的帶病率進行了重復檢測。結果顯示，33份谷子種子帶有貝西滑刃線蟲，與之前檢測結果一致，陽性重復率100%。將33份陽性谷子帶貝西滑刃線蟲頻率進行了統計，其中，C93帶病率最高，為100%；C65、C66、C67和C77共4份谷子品種帶病率最低，僅為33.3%；其余供試的谷子種子帶病率介于二者之間(表2)。33份帶貝西滑刃線蟲的谷子品種大部分來自春谷區(圖4)，在黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、陜西、山西、河北張家口這些地區均檢測到，而來自海南的5份種子中檢測到2份帶貝西滑刃線蟲。

三角形和圓形表示樣本所在地區，圓形表示具有陽性樣本的地區；分數表示該地區陽性樣本數占樣本數的比值。

The triangle and round indicate the location of the sample, and the round indicates positive samples；The score represents the ratio of positive samples to the total samples in the area.

圖4 帶貝西滑刃線蟲的谷子品種地理分布圖
Fig.4 Geographical distribution map of foxtail milletvarieties withAphelenchoidesbesseyi

2.4 貝西滑刃線蟲28S核糖體RNA序列的分析

對33份陽性種子攜帶的貝西滑刃線蟲28S核糖體RNA序列進行多態性分析，結果如表3所示。貝西滑刃線蟲基因種內多態性位點有29個，其中多變異位點3個，這些突變以A-G/T-C之間的轉換為主。貝西滑刃線蟲種內變異率為11.8%，基因中的GC含量為56.3%～57.1%，平均為56.7%，無明顯的堿基偏向性。

對33份貝西滑刃線蟲樣本序列進行分析，共檢測出22種單倍型，分別命名為AB1-AB22，并進行單倍型的多樣性分析，結果如表4。其中單倍型AB1出現的頻率最高，在具有陽性樣品的各省份中均可檢測到該單倍型。其余的單倍型僅出現過一次，屬于稀有單倍型。河北張家口和內蒙古松山區兩地的遺傳多樣性最為豐富。

表3 貝西滑刃線蟲樣本單倍型的變異位點Tab.3 Variation sites in haplotypes of Aphelenchoides besseyi

注：AB1-AB22.貝西滑刃線蟲單倍型(AB1 GenBank 登錄號：KX622689.1；AB2-AB22 GenBank 登錄號：MK204592-MK204612)。

Note: AB1-AB22.Haplotypes ofAphelenchoidesbesseyi(GenBank accession number of AB1: KX622689.1; GenBank accession number of AB2 to AB22: MK204592-MK204612)．

表4 貝西滑刃線蟲各地理種群單倍型統計Tab.4 Phenotypic statistics in different geographical populations of Aphelenchoides besseyi

3 結論與討論

本研究利用PCR技術對谷子種子是否攜帶貝西滑刃線蟲進行了檢測，這種快速檢測方法來自貝西滑刃線蟲雙重PCR檢測體系[21]，該方法共設計2對引物：內標引物F194/AB28以及特異性引物GU-F/GU-R，同時進行擴增，能快速準確鑒定出貝西滑刃線蟲。本研究中，選擇其特異性引物GU-F/GU-R對谷子種子DNA進行檢測，可準確擴增出陽性條帶，經測序驗證與貝西滑刃線蟲序列完全匹配；同時也選擇內標引物F194/AB28對種子DNA進行PCR擴增，擴增結果有2條大小不同的條帶：其中750 bp條帶匹配谷子序列，780 bp條帶匹配假單胞菌屬序列，測序比對結果均不匹配線蟲序列，這一結果與雙重PCR檢測體系結果并不一致。

傳統的PCR技術所使用的PCR模板，是采用CTAB方法從帶菌種子上分離的病菌DNA，此方法比較繁瑣, 也降低了PCR的靈敏度[13]。本試驗初期，曾使用試劑盒和CTAB 2種方法提取種子DNA，經PCR擴增結果比對發現，使用CTAB法提取的種子DNA擴增出的陽性條帶數量低于使用試劑盒提取的種子DNA擴增出的陽性條帶數量，且結果重復性不穩定，因此，選擇使用試劑盒來提取種子DNA。但種子中線蟲DNA提取與檢測效率容易受到線蟲蟲口數量和種子中雜質的影響，還需要對帶病種子中線蟲DNA的提取方法進行優化和改進。

董立等[4]對64份涵蓋東北春谷區、西北春谷區和華北夏谷區的谷子品種進行線蟲病抗性鑒定，發現大部分品種為感病品種。本試驗利用PCR方法檢測了99份谷子種子，33份種子檢測到攜帶谷子貝西滑刃線蟲，該樣品主要來自春谷區，這與其研究結果是一致的；此外，董立等[4]研究中的晉谷21號是高感品種。在本研究中有來自4個不同地區的晉谷21號(C59、C60、C61、C62)，除了C61未檢測到貝西滑刃線蟲外，其余3個地區的晉谷21檢測結果呈陽性；對于晉谷21號的2種檢測結果基本一致。

一些研究表明，谷子線蟲病是夏谷區重要的病害[4,26-28]，本研究結果發現除來自海南的C85(66.7%)和C86(55.6%)2個品種檢測到貝西滑刃線蟲外，在夏谷區(河北中南部和山東)并未檢測到貝西滑刃線蟲的存在。分析原因可能是，夏谷區線蟲病發生嚴重的谷穗會呈現紫色，肉眼容易分辨，在收獲時會舍棄病穗、留存健康穗的籽粒。這樣會導致本試驗來自夏谷區的樣品大部分是健康籽粒，樣品不攜帶線蟲或攜帶的線蟲蟲口數量極少，線蟲DNA相對于種子DNA濃度太低未檢測到。今后要繼續對夏谷區主推谷子品種種子進行線蟲的檢測，以了解夏谷區線蟲初侵染來源及發生規律。

本研究初步分析了33份陽性樣本的遺傳多樣性，從試驗結果可以看出28S rRNA片段適合用于研究貝西滑刃線蟲種群的遺傳多樣性。從研究結果可以看出，貝西滑刃線蟲AB1出現頻率最高，是優勢單倍型。其他單倍型僅出現過一次，屬于稀有單倍型。河北張家口和內蒙古松山區分別具有7，4種單倍型，說明兩地貝西滑刃線蟲的遺傳多樣性最為豐富。

種傳病害是一類以種子帶菌進行傳播和擴散的病害，號稱作物的“癌癥”，均為系統性侵染病害。被侵染植株攜帶大量的病原菌，使種子帶病為其遠距離傳播病害提供條件[4]。因此，種子帶線蟲的檢測是防止該病害擴散的重要環節。本試驗采用的PCR檢測技術方法簡單、快捷，只需要簡單的PCR儀器即可完成；使用特異性引物GU-F/GU-R對貝西滑刃線蟲的檢測具有較高的特異性和準確性。該方法的推廣可以加快線蟲檢測的進度，為種子線蟲檢測提供技術支持，有利于對谷子線蟲病害的發生與傳播進行防控，促進谷子產業的健康發展。