白色紫錐菊不定根抑制LPS誘導的小鼠巨噬細胞促炎介質的產(chǎn)生

高 原， 修景潤， 田 文， 樸炫春*， 廉美蘭

(1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2.延邊州農(nóng)業(yè)科學院，吉林 龍井 133400)

白色紫錐菊 [Echinaceapallid(Nutt.) Nutt.] 是菊科(Asteraceae)松果菊屬(Echinacea)多年生草本植物[1]，原產(chǎn)地北美地區(qū)，具有極高的藥用價值和觀賞價值[2]。白色紫錐菊含有豐富的活性物質，主要為菊苣酸、氯原酸以及紫錐菊苷等咖啡酸類衍生物[3]，它具有抗癌、增強免疫力、抗炎、抗菌等多種藥用功效[4]，在歐美地區(qū)是常見的藥用制劑材料之一[5]。近些年，紫錐菊(E.purpurea)和狹葉紫錐菊(E.angustifolia)等松果菊屬植物已經(jīng)被成功引種到我國的多個省份，但是白色紫錐菊因其種子休眠性強、萌發(fā)率低和育苗難度大等問題，人工栽培技術尚處于探究階段，其產(chǎn)量難以滿足產(chǎn)品生產(chǎn)的需求[6]。目前，已在許多植物種中通過培養(yǎng)植物細胞、組織、器官等方式獲取了有用代謝產(chǎn)物，這種技術被認為是一種解決植物材料不足的有效途徑[7]。對于白色紫錐菊，已有研究報道在生物反應器中大量培養(yǎng)不定根，并發(fā)現(xiàn)以這種方式生產(chǎn)的活性物質產(chǎn)量高于其母體植物[8]。然而，目前為止不定根未能應用于商品生產(chǎn)，其主要原因是不定根安全性、生物活性等尚未得到評價。

炎癥是很多疾病的病理演變過程，最開始多是急性炎癥，后來逐漸演變?yōu)槁匝装Y。脂多糖(LPS)能夠刺激巨噬細胞誘導形成多種炎癥通路，從而產(chǎn)生促炎介質[9]。目前， MAPKs信號通路已經(jīng)成為抗炎方面研究的熱點，一般情況下,MAPKs信號通路被激活之后， p38、JNK、ERK都會產(chǎn)生一定程度的磷酸化，并且會進一步促進PGE2、NO、COX-2、iNOS和TNF-α等促炎介質的釋放[10]。植物提取物有效成分來源于植物體，具有穩(wěn)定和安全等優(yōu)點，研究發(fā)現(xiàn)許多植物提取物都可以有效抑制炎癥反應[11-13]。在相關研究中，對于松果菊屬紫錐菊的抗炎方面研究相對較多[14]。但是，白色紫錐菊抗炎效果的研究甚少，對所培養(yǎng)的不定根抗炎研究更是無人問津。因此，為不定根今后作為一種新植物材料應用于白色紫錐菊相關產(chǎn)品的生產(chǎn)，此試驗探究了白色紫錐菊的生物反應器不定根提取物，抑制在LPS-誘導后對小鼠巨噬細胞的促炎介質產(chǎn)生的影響；同時，對MAPK通路蛋白磷酸化程度進行了測定，旨在探明不定根提取物是否通過調控MAPK通路起到抗炎效果。

1 材料與方法

1.1 材料

白色紫錐菊不定根材料由大連市農(nóng)業(yè)科學研究院提供。將培養(yǎng)至30 d的不定根切成約1 cm長，接種到含不定根增殖培養(yǎng)基的生物反應器中(圖1)。反應器大小5 L，工作體積4 L，培養(yǎng)基為3/4 MS+IBA 1 mg/L+蔗糖50 g/L，pH值5.8。通氣量為100 mL/min的氣體，暗培養(yǎng)溫度為(25 ± 1 ) ℃。培養(yǎng)35 d后，收獲不定根，用清水清洗后，置于55 ℃烘干箱中，當不定根烘干至恒重(48 h)后作為試驗材料。

注：A.在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到35 d時的不定根；B.在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到35 d時的不定根形態(tài)；C.不定根生物反應器培養(yǎng)

圖1 白色紫錐菊不定根

Fig.1 Adventitious roots culture ofE.pallida

1.2 試劑

DMEM(Thermo Scientific, USA)培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS, Thermo Scientific, USA)和青霉素、鏈霉素和3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide(MTT)(Sigma 公司，美國)，COX-2 、TNF-α 、IL-6、IL-1β 等抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)，LPS和ATP(Invivogen公司，美國)。

1.3 儀器與設備

UV-2600型號酶聯(lián)免疫檢測儀(日本島津公司，日本)，Bio-Rad型號蛋白質電泳及轉印設備(伯樂生命醫(yī)學公司，中國)，LAS-3000型號凝膠成像儀(FUJIFILM公司，日本)。

1.4 方法

1.4.1 巨噬細胞的獲取

試驗用小鼠腹腔巨噬細胞來自6～8周齡體重約為18 g的C57BL/6鼠(長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，中國長春)。小鼠腹腔內注射4%巰基醋酸鹽培養(yǎng)液，在溫度25 ℃，相對濕度50%的環(huán)境中飼養(yǎng)4 d后犧牲小鼠。用10 mL預冷磷酸緩沖液(PBS)沖洗小鼠腹腔，吸出腹腔灌洗液。將腹腔灌洗液在離心機1 500 r/min離心4 min，棄上清后，即得巨噬細胞。將得到的巨噬細胞在DMEM培養(yǎng)液[包含1%(v/v)抗生素(青霉素和鏈霉素, 100 U/mL)和10%(v/v)胎牛血清]中，在相對濕度95%，CO2含量5%，溫度37 ℃的條件下孵育12 h，然后用于試驗。

1.4.2 提取物制備

將400 mL 的80%甲醇加入到稱好的30 g不定根干品中，在37 ℃條件下超聲1 h，收集濾液，重復3次，將收集的濾液在45 ℃減壓濃縮干燥，得到不定根提取物，用DMSO溶解后用于實驗。

1.4.3 白色紫錐菊不定根提取物對巨噬細胞活性的影響

采用MTT法測定白色紫錐菊不定根提取物細胞的毒性。在96孔板的每孔中接種細胞密度為8×104個的巨噬細胞，孵育12 h后棄掉原培養(yǎng)液并加入不同濃度的提取物(25、50、100、200、400g/mL)，對照加入DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，并在每孔中加0.1 mL含500g/mLMTT的DMEM培養(yǎng)基，處理2 h。棄上清液后，分別向每孔加入0.1 mL DMSO，震蕩(300 r/min)培養(yǎng)5 min，在550 nm處測定吸光值。

1.4.4 試驗組設計

試驗共設計6個組。1) Cont：正常巨噬細胞；2) LPS：僅用LPS(0.1g/mL)處理；3) E100：僅用100 μg/L提取物處理；4) LPS+E25(低劑量)：用25 μg/L提取物處理后再用LPS(0.1g/mL)處理；5) LPS+E50(中劑量)：用50 μg/L提取物處理后再用LPS(0.1g/mL)處理；6) LPS+E100(高劑量)：用100 μg/L提取物處理后再用LPS(0.1g/mL)處理。

1.4.5 NO和PGE2的測定

在48孔板中接種0.3 mL細胞密度為2.5×105的培養(yǎng)液，孵育12 h后，倒掉培養(yǎng)基，用溫PBS沖洗兩次，加入提取物處理1 h后，向每孔加入0.1 μg/mL LPS進行處理，24 h后收集細胞上清液，用于NO和PGE2的測定。用Griess試劑法測定NO，與細胞上清液的混合比例為1∶1，在酶標儀550 nm處測定吸光值。按ELISA試劑盒法測定PGE2，并在450 nm處測定吸光值。

1.4.6 iNOS和COX-2的測定

向6孔板中每孔加入2 mL細胞濃度為2.6×106細胞培養(yǎng)液，經(jīng)過12 h孵育后，棄原培養(yǎng)液，用溫的PBS沖洗3次，并加入提取物處理1 h，再加入0.1 μg/mL LPS處理24 h后，棄掉上清液。用預冷的PBS沖洗3次，向6孔板中分別加入裂解液100 μL，用細胞鏟獲得細胞后，冰浴30 min。在12 000 r/min離心機中離心15 min，獲得的上清液用BCA法測定蛋白含量，進行免疫印跡分析。按照4∶1體積比將上清液和上樣緩沖液混合，并在沸水中煮5 min后冷卻至室溫。在恒定電壓為120 V的條件下進行70 min的SDS-PAGE電泳。結束后，設置恒壓為70 V，冰浴3 h，進行轉膜。轉膜后，用PBS-T洗5 min，重復3次。在室溫條件下，用10%脫脂奶封閉1 h。將一抗iNOS、COX-2稀釋1 000倍后，在PVDF膜上孵育過夜，溫度4 ℃。將二抗稀釋5 000倍后，室溫條件下孵育1 h。顯影采用ECL化學發(fā)光法，并使用Image J軟件分析蛋白的表達量。

1.4.7 TNF-α、IL-6和IL-1β的測定

用ELISA法測定TNF-α、IL-6和IL-1β。為了測定TNF-α和IL-6，細胞處理的方法與測定NO和PGE2一樣。測定時均按照TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒中的說明書操作，并在450 nm處測定吸光值。同樣為了測定IL-1β，細胞處理與測定TNF-α和IL-6一樣，加入白色紫錐菊提取物處理1 h，再加入5 mM ATP處理1 h，獲得細胞的上清液。測定時均按照IL-1β試劑盒中的說明書操作，并在450 nm處測定吸光值。

1.4.8 p38、JNK和ERK測定

用免疫印跡法測定p38、JNK和ERK磷酸化水平。細胞處理方法與測定iNOS或COX-2方法相同。用0.1 μg/mL LPS處理，30 min后的操作與測定iNOS或COX-2相同。轉膜后，用TBS-T(Tris-buffered saline, 0.1%Tween 20)洗膜5 min，重復3次。室溫下，用10%脫脂奶封閉1 h。在4 ℃條件下，PVDF膜在稀釋1 000倍的一抗(p-p38、p-JNK、p-ERK、p38、JNK、ERK和β-actin)中孵育過夜。室溫條件下，將二抗稀釋5 000倍后孵育1 h。采用ECL化學發(fā)光法，并利用Image J軟件分析蛋白的表達量。

1.4.9 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗處理都進行3次重復，應用GraphPad Prism 5軟件程序，并采用 t 測驗法對數(shù)據(jù)進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 不定根提取物對小鼠巨噬細胞活性的影響

當不定根提取物濃度低于400 μg/mL時對細胞活性表現(xiàn)出無抑制作用(圖2)，說明400 μg/mL濃度的不定根提取物沒有毒性。因此，選用25、50和100 μg/mL的不定根提取物用于抗炎研究。

圖2 白色紫錐菊不定根提取物對于細胞活性產(chǎn)生的影響

2.2 白色紫錐菊不定根提取物對NO、PGE2釋放量產(chǎn)生的影響

由圖3可知，加入LPS刺激后，巨噬細胞中的NO和PGE2水平均明顯提高，但當提取物濃度為50 μg/mL時，顯著抑制NO的產(chǎn)生。當濃度達到100 μg/mL，抑制率達到62%(圖3A)。同時,顯著抑制PGE2(圖3B)。

注:與Cont組相比，###表示P<0.001;與LPS組相比，*、**和***分別表示P<0.05，P<0.01和P<0.001。

圖3 不定根提取物對NO和PGE2產(chǎn)生的影響

Fig.3 Effect of adventitious roots extract on NO and PGE2production

2.3 白色紫錐菊不定根提取物對iNOS、COX-2表達量的影響

由圖4可知，白色紫錐菊不定根提取物對于iNOS、COX-2的釋放表現(xiàn)出抑制效果，iNOS、COX-2的表達量在經(jīng)過LPS的刺激后會顯著地增加，而經(jīng)過提取物處理后的試驗組中卻出現(xiàn)了下降趨勢，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，在100 μg/mL的提取物濃度處，對iNOS和COX-2表達的抑制率分別達到了33%和30%(圖5)。

圖4 不定根提取物對iNOS和COX-2蛋白表達量的影響

2.4 白色紫錐菊不定根提取物對IL-1β、IL-6和TNF-α釋放量產(chǎn)生的影響

IL-1β、IL-6、TNF-α 3種炎癥因子在炎癥反應中起著關鍵性作用。經(jīng)LPS刺激后的小鼠巨噬細胞中TNF-α和IL-6的釋放量表現(xiàn)為顯著增加。在100 μg/mL提取物濃度處，對TNF-α和IL-1β的抑制率分別達到51%和58%。而提取物對IL-6的釋放量無明顯抑制作用(圖6)。

注:與Cont組相比，###表示P<0.001;與LPS組相比，*、**和***分別表示P<0.05，P<0.01和P<0.001。

注:與Cont組相比，###表示P<0.001;與LPS組相比，**和***分別表示P<0.01和P<0.001。

2.5 白色紫錐菊不定根提取物對MAPKs信號通路中的信號蛋白磷酸化的影響

MAPKs作為細胞中的一類蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，主要包括p38、ERK、JNK等幾種蛋白。由圖7可知，小鼠巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后，促進了p38、ERK和JNK的磷酸化，但在加入白色紫錐菊不定根提取物處理后，巨噬細胞中p-p38、p-ERK、p-JNK的表達量呈明顯下降的趨勢，且表現(xiàn)出一定程度的濃度依賴性，在處理濃度為100 μg/mL時，p-p38、p-ERK和p-JNK抑制率分別達到78%、37%和60%(圖8)。

圖7 不定根提取物對p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白表達量的影響

注:與Cont組相比，###表示P<0.001;與LPS組相比，***表示P<0.001。

3 討論

生物反應器培養(yǎng)不定根具有培養(yǎng)時間短、安全性高、不受時間、氣候和地點的局限、次生代謝物產(chǎn)量多等優(yōu)點，顯著加速了中藥現(xiàn)代化進程。目前，已有許多植物成功地應用了生物反應器培養(yǎng)，李惠娟等探究了氧化鍺對于生物反應器中人參的不定根生長產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)氧化鍺濃度為30和60 μmol是不定根生長的最適宜濃度[15]。左北梅等研究發(fā)現(xiàn)，120°圓錐型氣升式的生物反應器培養(yǎng)的人參不定根，在第40天時干重總量和干重增殖倍數(shù)會達到峰值，總皂苷及多糖含量也達到最高[16]。松果菊屬不定根培養(yǎng)研究也有許多報道，已成功地在生物反應器中培養(yǎng)了狹葉紫錐菊[17]和紫錐菊[18]不定根。本研究團隊對白色紫錐菊也進行了生物反應器培養(yǎng)研究，并建立了培養(yǎng)體系[19]。目前，不定根培養(yǎng)研究在活躍的開展，但對其生物活性研究較少，其中研究較多的是抗氧化研究，但至今關于白色紫錐菊不定根抗炎作用相關的研究報道較少[20]。隨著天然提取物在食品添加劑、醫(yī)療保健、化妝品等方面的更多應用，再加上市場需求的不斷加大[21]。為了使培養(yǎng)白色紫錐菊不定根應用于產(chǎn)品生產(chǎn)，本研究對白色紫錐菊不定根的抗炎作用進行了初步探究，希望能夠對白色紫錐菊生產(chǎn)應用提供科學依據(jù)。

NO是經(jīng)過其合酶iNOS催化L-精氨酸后產(chǎn)生，是炎癥反應檢測的重要指標之一，對于炎癥反應的產(chǎn)生起著非常重要的作用。NO的過量產(chǎn)生，通常會對細胞造成損傷，進一步導致組織壞死，加速炎癥的發(fā)展。Zhai等對于白色紫錐栽培根的相關研究發(fā)現(xiàn)，栽培根的提取物濃度為100 μg/mL時，對NO的抑制率達到40%[22]。在本試驗中，100 μg/mL的白色紫錐菊不定根提取物對NO的抑制率能夠高達62%。說明白色紫錐菊不定根的抗炎效果要好于栽培根，且25 μg/mL提取物濃度下，對于iNOS的表達有顯著的抑制效果。PGE2是一種強促炎因子，COX-2是PGE2生產(chǎn)的關鍵酶。相關研究證明，紫松果菊根的提取物顯著地抑制了PGE2的釋放[23]，而且，還有研究發(fā)現(xiàn)，狹葉紫錐菊根的己烷提取物顯著地抑制了COX-2表達，表現(xiàn)出較好的抗炎活性[24]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，當不定根提取物濃度達到100 μg/mL時，顯著地抑制了iNOS、COX-2的表達。在炎癥反應的整個過程中，巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等幾種增殖細胞都參與到IL-1β、IL-6、TNF-α等多種細胞因子的合成和釋放[25]。還有研究發(fā)現(xiàn)，紫松果菊揮發(fā)油能夠顯著地抑制TNF-α、IL-6的釋放[26]。而在本試驗中，白色紫錐菊不定根的提取物對TNF-α、IL-1β的釋放也表現(xiàn)出顯著的抑制效果，而對IL-6的釋放卻沒有產(chǎn)生影響。

對于抗炎信號通路的研究，MAPKs信號通路在大多數(shù)炎癥細胞內均有發(fā)現(xiàn)，在細胞生物學的反應過程中起著非常重要的作用。MAPKs主要包括p38、ERK、JNK，其活化途徑具高度保守性，能夠活化巨噬細胞釋放促炎因子。ERK可被各類因子及神經(jīng)遞質等多種信使分子刺激而活化，主要發(fā)揮細胞增生和分化作用，在細胞凋亡方面也有相應作用，該活化后效應主要取決于轉導信號的作用時間長短和強度大小[27]。相關研究表明，p38和JNK兩種傳導通路主要參與細胞凋亡過程，能夠介導細胞對抗應激反應，可被多種信號活化[28]。通常情況下，植物多糖的毒副作用都非常小[29]。相關研究對紫錐菊多糖進行分析，探究其參與信號通路的調控機制，結果發(fā)現(xiàn)，紫錐菊多糖對于ERK、JNK 、p65、p38的磷酸化能夠產(chǎn)生有效的抑制，且對MAPK信號通路的轉導也會產(chǎn)生抑制[30]。徐歆[31]研究發(fā)現(xiàn)，紫錐菊的提取物可調控TLR及其銜接分子MyD88、TRIF的基因表達，并激活信號分子ERK、JNK、p38MAPK及NF-κB，以調節(jié)小鼠BMDM的細胞因子分泌和NO合成。而在本試驗中，不定根提取物顯著地抑制了MAPKs信號通路中的p38、ERK和JNK的磷酸化，從而說明白色紫錐菊不定根的提取物通過調控MAPKs信號通路的傳導，進而起到抗炎作用。

4 結論

通過生物反應器培養(yǎng)的白色紫錐菊不定根，其提取物對經(jīng)LPS誘導后的小鼠巨噬細胞中的促炎介質(TNF-α、NO、IL-lβ和PGE2)的釋放以及COX-2、iNOS的表達具有顯著的抑制作用；且能夠顯著地抑制MAPKs信號通路傳導中的p38、ERK、JNK的磷酸化。因此，白色紫錐菊不定根作為一種新型的植物材料，可用于今后抗炎產(chǎn)品的開發(fā)和利用。