膜莢黃芪查爾酮合成酶基因的克隆與表達分析

鄭涵予， 袁 元， 金河延， 于 洋， 全雪麗， 吳松權

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根的統稱[1]。膜莢黃芪為多年生草本，高達50～100 cm，莖直立，上部多分枝，莖上有細棱，幼莖淡綠色，被白色長柔毛[2]。黃芪具有補氣、利尿、保肝、祛痰等功效，有效成分主要包括皂苷類、黃酮類、多糖類和一些微量元素[3-4]。黃芪黃酮類化合物具有抗氧化、降血糖、抗病毒、保護神經和骨骼、抑制黑色素形成、改善疲勞等藥理作用[5]及藥用價值[6-7]。屬我國傳統中藥材，分布于我國溫帶和暖溫帶地區，尤其以東北和華北地區分布廣泛[8]。黃芪中黃酮類化合物主要是異黃酮，包括芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷等[5,9]；其中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷是評價黃芪藥材質量的“標記化合物”之一[1]。

查爾酮合成酶(Chalconesynthase,CHS)是黃酮類生物合成途徑中的關鍵酶和限速酶，催化3分子丙二酸單酰CoA和1分子香豆酰CoA形成查爾酮[10]。此外，CHS還是與植物抗性相關的基因，CHS基因的表達受到草食動物、病菌等生物脅迫和紫外線、損傷和外源激素等非生物脅迫的誘導。而且，利用茉莉酸甲酯處理模擬環境脅迫時，不僅上調了毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)中CHS基因表達，還增加了總黃酮的含量和抗氧化活性[11]。因此，CHS基因是與植物抗逆境和次生代謝產物緊密相關的基因，在植物的抗性脅迫中發揮著重要的作用，它的正確表達不僅有利于提高黃酮類含量，而且還可以改善植物的抗逆能力。本研究的目的是克隆膜莢黃芪CHS基因并分析其轉錄表達特性，為分子水平上了解異黃酮積累規律和發掘優良種質提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 植物材料

取新鮮的膜莢黃芪根、莖、葉，一部分用液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中；另一部分于55 ℃烘干箱中烘干后，用于異黃酮類的提取。

1.1.2 藥品和試劑

Trizol(Invitrogen)；反轉錄試劑盒(Toyobo)；超微量分光光度計(NanoDrop 2000 C)；DNA凝膠回收試劑盒(Omega)；PMD-19T載體(Takara)；大腸桿菌Jm109；5′和3′RACE 試劑盒(Clontech)；熒光定量試劑盒 SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara)；芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷等異黃酮對照品,購自上海融禾醫藥科技有限公司；色譜級乙腈和甲醇；超純水；其它試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器

超低溫冰箱(W-86L388A)；干燥箱(BAO-250A)；高速冷凍離心機(Hitachi)；PCR儀(T100)；凝膠成像系統(BioDoc-It220)；實時熒光定量PCR儀(Mx3005P)；RE-2000B型旋轉蒸發儀；C18色譜柱(Acchrom)；高效液相色譜儀(LC-10ATVP Plus)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

采用Trizol一步法提取總RNA(Invitrogen)，超微量分光光度計檢測其質量和濃度，將總RNA稀釋成0.5 μg/L，利用反轉錄PCR(RT-PCR)合成cDNA第1條鏈。

1.2.2CHS基因克隆

根據GenBank中發表的CHS基因序列的編碼區設計1對簡并引物AmCHS-DF和AmCHS-DR(表1)。

表1 引物序列

以合成的cDNA為模板，進行PCR反應，退火溫度為52 ℃。根據所測得的AMCHS基因的保守區設計5′-RACE引物AmCHS-gsp1和3′-RACE引物AmCHS-gsp2(表1)，按照Clontech公司RACE cDNA說明書進行RACE反應， 從膜莢黃芪的cDNA擴增得到RACE序列。PCR產物經瓊脂糖電泳回收后，克隆到pMD19-T載體，篩選陽性克隆，測序由上海英俊生物有限公司完成并獲得cDNA全序。

1.2.3 生物信息學分析

利用Lasergene軟件包中EditSeq分析基因的開放閱讀框(ORF)；使用在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的理化性質；使用在線工具TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白跨膜結構域；使用在線工具Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預測蛋白質二級結構，使用在線工具TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和Wolf PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)預測亞細胞定位情況；使用在線工具SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽；使用NCBI在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)和Prosite(https://prosite.expasy.org/)分析保守結構域和活性位點；使用在線工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)檢索同源性氨基酸序列；利用Lasergene軟件包MegAlign構建CHS氨基酸序列的系統發育進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR

針對AmCHS基因序列設計1對特異引物，Am18S基因作為內參(表1)，在熒光定量PCR儀(Mx3005P)進行實時定量PCR(qRT-PCR)反應。具體反應按照SYBR Premix Ex TaqⅡ說明書進行qRT-PCR，求出相對于內參基因Am18S的相對表達量。

1.2.5 異黃酮含量的測定

采用HPLC法[12]。異黃酮的含量等于芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量之和。

1.3 數據分析

應用SPSS19.0軟件中的方差分析，多重比較采用Duncan新復極差法(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 AmCHS基因cDNA克隆

以膜莢黃芪cDNA第1條鏈為模板，用簡并引物PCR擴增，獲得了1條大約1 150 bp的保守區片斷(圖1泳道1)。依據保守區設計的特異引物進行5′-RACE 和3′-RACE結果，分別獲得了1條大約300 bp的5′端(圖1泳道2)和450 bp的3′端(圖1泳道3)。經300 bp的5′端的和450 bp的3′端的引物擴增后的PCR產物，測序和拼接獲得了長度為1 473 bp的AmCHS基因的全長cDNA序列，GenBank登陸號為KY086285。

注：M.DL 2 000 標準；1.簡并引物PCR；2. 5′-RACE；3. 3′-RACE

圖1 膜莢黃芪CHS基因PCR結果

Fig.1 The PCR results ofCHSgene

2.2 AmCHS生物信息學分析

AmCHS的cDNA序列和氨基酸序列如圖2所示。AmCHS的cDNA序列全長為1 473 bp，開放閱讀框(ORF)長度為1 170 bp，5′-端非翻譯區為151 bp，3′-端非翻譯區為127 bp，還有25 bp的polyA尾，A+T含量為59.0%，G+C含量為41.0%(圖2)。

AmCHS蛋白編碼389個氨基酸，分子式為C1914H3053N509O564S19，分子量為42 828.51 Da，等電點為6.05；強堿性氨基酸43個，強酸性氨基酸47個，極性氨基酸87個，疏水性氨基酸143個；不穩定指數為37.16，屬于穩定蛋白；親水性指數為-0.075，屬于可溶性蛋白；定位在細胞質。二級結構預測結果，AmCHS蛋白以α-螺旋(37.94%)和無規則卷曲(44.99%)為主，β-片層(16.20%)含量則較少。此外，AmCHS不存在跨膜結構域和信號肽，定位于細胞質。這些理化特性與其它植物CHS蛋白類似[5-6]。

NCBI在線工具CDD功能結構域分析表明，AmCHS屬于查爾酮合成酶家族。Prosite活性位點分析結果，AmCHS蛋白的近中心位置附近有1個聚酮合成酶的催化活性位點(C164)，此位點的功能是結合香豆酰CoA，并且這一位點區域(RYMMYQQGCFAGGTVLR)也非常保守(圖2)，是CHS和白藜蘆醇合酶等聚酮合成酶的特征序列[13]。同時，AmCHS蛋白還包括CHS蛋白特有的保守殘基F-215、H-303、N-336[14]。

圖2 膜莢黃芪CHS基因的全長 cDNA序列及其氨基酸序列

同源性檢索分析表明，AmCHS蛋白與其它植物CHS蛋白同源，相似性大于77.6%。為了進一步了解AmCHS和其它植物CHS進化關系，從Genbank中下載了不同植物的12個CHS蛋白序列，構建了系統進化樹(圖3)。

圖3 膜莢黃芪CHS與其它植物CHS氨基酸序列的系統進化樹

由圖3可知，AmCHS與豆科植物地三葉(Trifolium subterraneum)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、豌豆(Pisum sativum)、大豆(Glycine max)的CHS歸為一類，而廖科植物苦蕎(Fagopyrum tataricum)、十字花科植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)、茄科植物馬鈴薯(Solanum tuberosum)、唇形科植物紫蘇(Perilla frutescens)和禾本科植物小麥(Triticum aestivum)的CHS各歸為一類，反應了CHS在進化上的保守性和不同科之間的多態性。

2.3 AmCHS組織特異性表達與總黃酮含量的變化

AmCHS熒光定量分析結果顯示(圖4)，AmCHS基因在根、莖、葉中均表達，但表達水平顯著不同，在葉中表達量最高，在莖中表達量次之，根中表達量最低。不同組織中總黃酮含量大小順序(圖5)與AmCHS基因的組織特異性表達結果一致，即葉>莖>根。

圖4 膜莢黃芪AmCHs基因組織特異性表達

圖5 膜莢黃芪不同組織中總黃酮含量

3 討論與結論

商品黃芪主要來源于人工栽培，但是栽培的黃芪中異黃酮含量不穩定[15]。CHS基因是生物合成黃酮類化合物的關鍵基因[10-11]。但是，尚未發現基于同源克隆和RACE技術克隆膜莢黃芪CHS基因的報道。本研究在應用同源克隆方法時，針對起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)分別設置了上游和下游簡并引物(表1)，經RT-PCR和測序獲得了含ORF在內的保守序列(圖2)，說明了這種方法的可行性，從而省略了后續克隆ORF的步驟，簡化了整個實驗過程。生物信息學分析結果顯示，所克隆的AmCHS基因的編碼區大小、理化性質等與其它植物CHS相似，具備查爾酮合成酶家族中4個氨基酸決定的活性位點(C164、F-215、H-303、N-336)，而且與其它植物CHS基因同源，表明AmCHS基因是CHS基因家族的新成員。

CHS基因常以基因家族的形式存在[11]。在大豆中CHS基因家族聚為2大類，CHS7和CHS8基因聚為一類,其它CHS基因聚為另一類，其中,只有CHS7和CHS8基因的表達與異黃酮的生物合成相關[16]。在黃芪中，異黃酮類化合物作為植物防御系統的組分，具有很多藥理作用，廣泛分布于植物的根、莖和葉中[17]。本研究中，AmCHS基因在膜莢黃芪根、莖和葉中的表達水平與異黃酮在根、莖和葉中的積累變化一致(圖4,5)，而且相對于大豆CHS3基因，AmCHS與大豆CHS7和CHS8基因的親緣關系較近(圖3)，推測AmCHS基因在膜莢黃芪異黃酮生物合成中發揮著重要的作用。有研究表明，CHS基因的表達與植物的抗性脅迫相關[11], 而且品種之間CHS基因的表達差異很可能是造成黃酮類含量差異的一個重要原因[16]。因此，考察CHS基因在黃芪不同種質之間的表達特性，還有利于篩選優良的黃芪種質。

總之，本研究從膜莢黃芪中克隆了AmCHS基因，證明AmCHS基因的表達與總黃酮的積累相關，從而為黃芪異黃酮類化合物生物合成機制的研究奠定了基礎。