均勻設計法優(yōu)化人參單芽誘導生根培養(yǎng)基

陳雙越, 包悅琳, 陳 鴿， 李 昂， 金東淳

(延邊大學農學院，吉林 延吉 1330021)

人參具有重要的醫(yī)療保健價值和巨大的經(jīng)濟效益，自古以來就被人們視為珍品[1-3]。但是人參的生長周期長、繁殖系數(shù)少、常異花授粉等生物學特性嚴重制約著品種選育進程，同時也是基礎性研究遠遠落后于其它植物的主要原因[4]。利用組織培養(yǎng)方法，建立高效、穩(wěn)定的人參再生植株體系是克服這些不利因素，加快新品種選育進程，提高基礎研究水平的有效途徑[5-7]。然而，人參的常規(guī)組織培養(yǎng)同樣存在難度大、發(fā)根難、再生植株頻率低等諸多問題[8-9]。鑒于人參繁殖及育種的難題，國內外研究人員試圖通過生物技術及轉基因技術擺脫人參生產(chǎn)及育種上的困境[10]。如通過建立人參的組織快速培養(yǎng)體系，大量繁殖人參苗來緩解生產(chǎn)上的需求，或在組培體系基礎上利用轉基因技術對現(xiàn)有的品種進行改良，亦或通過調控光、溫、生長調節(jié)劑等來促使試管苗開花結實來縮短其育種周期等[11-14]。雖然已有很多關于人參組織培養(yǎng)方面的報道，但尚未見有穩(wěn)定的體系在育種及生產(chǎn)上應用，因此有必要建立一套有效的人參組培體系，以期為人參育種的后續(xù)研究奠定理論基礎[15-18]。

長期以來，國內外針對建立完整的人參組織培養(yǎng)體系做了大量研究[19]。雖然已經(jīng)有一些關于人參組培體系建立的報告，其中提到的各種激素濃度為人參組培的進一步研究提供了參考[20-22]。但目前發(fā)現(xiàn)的報告中，大多是采用單因素研究方法，這種方法有可能會漏掉一些較優(yōu)的組合。而使用均勻設計恰好能規(guī)避這個弊端，既能夠保證試驗的均勻性和準確性，又能大大減少試驗次數(shù)，且目前尚未有采用均勻設計優(yōu)化人參組織培養(yǎng)中各激素配比的相關報道[23]。

本試驗以MS為基本培養(yǎng)基，大田生長的人參葉片為試材，采用均勻設計方法設計不同氮濃度、不同種類的激素組合，探討并篩選了人參葉片愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基，以期建立高效、穩(wěn)定的人參再生植株體系，為后續(xù)育種試驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采集試驗田的人參葉片，將采集的人參葉片放在水流中清洗，以除去表面污垢。再將人參葉片放入滅菌后的燒杯中，在無菌條件下用75%乙醇浸泡30 s，將其取出用無菌水沖洗2次，每次5 min。然后將葉片浸入0.1%升汞溶液中，浸泡6 min，并不斷晃動燒杯，之后用無菌水洗滌3次，每次5 min，最后用無菌水浸泡以備用。

1.2 方法

1.2.1 人參葉片愈傷組織的誘導

在無菌條件下將備好的人參葉片用刀切成小塊，用鑷子將愈傷組織接種在2,4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.66 mg/L+1%瓊脂，pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，并設置培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2.2 人參不定芽的誘導

將帶有愈傷組織的人參葉片接種在IBA 3 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 3 mg/L+1%瓊脂，pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，然后置于光照時長為16 h/d，溫度為25 ℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.3 誘導生根

將帶有不定芽的愈傷組織切成單芽并以MS為基本培養(yǎng)基，附加瓊脂8 g/L，pH值為5.8。將NO3-、NH4+與NAA、KT、IBA、6-BA、IAA、GA36種生長調節(jié)劑，參照均勻設計U15(158)，設計8個因素，每種因素為15水平(表1)，每處理10瓶，每瓶1枚外植體。30 d后統(tǒng)計人參單芽生根數(shù)，生根后的根粗、根長、莖粗、莖長。通過分析得到最佳激素組合后，在添加有最佳激素組合的培養(yǎng)基中接種人參帶有愈傷組織的單芽進行驗證。

表1 人參單芽U15(158)試驗設計

1.2.4 移栽

打開已經(jīng)生根的試管瓶進行煉苗，煉苗的必備條件是溫度25 ℃，5 000～10 000 lx的光照強度，時間為4～6 d。當有小的菌落剛剛出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面時，及時地將試管苗從試管瓶中移出。

2 結果與分析

2.1 不同處理對單芽生根率的影響

接種后，每7 d觀察1次單芽生根情況，28 d時統(tǒng)計單芽生根的誘導情況。通過觀察培養(yǎng)14 d后開始有根出現(xiàn)。28 d后統(tǒng)計各處理單芽生根率(圖1)。由表2可知，7號處理的單芽生根率最高，為90%，其次為11號50%，5號40%，3號、6號、8號、9號都為30%，10號、12號、14號都為20%，4號、13號都為10%，而1號、2號、15號處理的單芽沒有生根。

表2 單芽生根率

2.2 不同處理對單芽地上部的影響

28 d后統(tǒng)計各處理單芽地上部情況(表3)。由表3可知，8號處理莖粗增長值最大，為0.04 cm，其次為3號、5號6號、7號、12號，都為0.03 cm，1號、10號、15號都為0.02 cm，2號、4號、9號、11號、13號、14號都為0.01 cm。7號處理莖長增長值最大，為0.17 cm，其次為8號0.13 cm，3號、6號、12號都為0.11 cm，4號、11號都為0.06 cm，13號0.05 cm，1號0.04 cm，15號0.03 cm，5號、10號、14號都為0.02 cm，2號、9號都為0.01 cm。

表3 單芽地上部試驗結果

2.3 不同處理對單芽地下部的影響

28 d后統(tǒng)計各處理單芽地下部情況(表4)。

表4 單芽地下部試驗結果

由表4可知，7號處理根粗增長值最大，為0.32 cm，其次為14號0.28 cm，10號0.26 cm，3號0.24 cm，5號、8號都為0.22 cm，12號0.20 cm，9號0.18 cm，11號0.15 cm，13號0.08 cm，6號0.06 cm，4號0.02 cm，1號、2號、15號都為0。7號處理根長增長值最大為1.03 cm，其次為14號0.89 cm，5號0.83 cm，3號0.78 cm，10號0.76 cm，8號、12號都為0.66 cm，11號0.33 cm，13號0.27 cm，4號、9號都為0.24 cm，6號0.20 cm，1號、2號、15號都為0。

2.4 偏最小二乘回歸建模分析結果

使用DPS中的偏最小二乘回歸分析程序對試驗數(shù)據(jù)進行分析，參考PRESS統(tǒng)計量以及誤差統(tǒng)計量的下降趨勢，選擇5個潛變量個數(shù)，建立二次多項式回歸模型，得到各因子與5個指標間的主效應標準回歸系數(shù)。其中，NH4+(X2),NAA(X3)，IBA(X5),6BA(X6)和GA3(X8)對單芽生根率(Y1),生根后莖粗的增長值(Y2),生根后莖長的增長值(Y3),生根后根粗增長值(Y4)和生根后根長增長值(Y5)的影響為正效應，NO3-(X1),KT(X4)及IAA(X5)對單芽生根率(Y1),生根后莖粗的增長值(Y2),生根后莖長的增長值(Y3),生根后根粗增長值(Y4)和生根后根長增長值(Y5)的影響為負效應。

由表5可知，提取不同潛變量個數(shù)增加時，標準化后的數(shù)據(jù)模型誤差平方和及PRESS統(tǒng)計量呈下降趨勢，且潛變量個數(shù)為5時，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5的誤差平方和分別為0.048 7，0.047 6，0.046 7，0.048 0，0.047 0，小于0.05，表明分析具有顯著性，相應的決定系數(shù)分別為0.928 5，0.831 4，0.858 9，0.894 9，0.880 7，說明潛變量對因變量的解釋能力很強，回歸模型的擬合效果較好(決定系數(shù)R2接近1，說明潛變量對因變量的解釋能力越強，回歸模型擬合效果越好)。

在DPS軟件中設定需要的優(yōu)化條件為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5取最大值，對以上5個模型進行優(yōu)化，得到各因素的最優(yōu)值：當X1(NO3-)為3 mg/L，X2(NH4+)為7 mg/L，X3(NAA)為0.1 mg/L，X4(KT)為0.1 mg/L,X5(IBA)為8 mg/L，X6(6-BA)為0.125 mg/L，X7(IAA)為0.15 mg/L,X8(GA3)為6 mg/L時，有最優(yōu)目標函數(shù)值，其中，Y1=96%，Y2=0.13 cm，Y3=0.07 cm，Y4=0.32 cm，Y5=1.02 cm。

表5 數(shù)據(jù)標準化后的模型誤差平方和及決定系數(shù)

2.5 驗證試驗結果

在添加最佳激素組合的培養(yǎng)基中接種人參單芽，30 d后生根誘導率達95%，生根后莖粗的增長值為0.09 cm,生根后莖長的增長值為0.07 cm,生根后根粗增長值為0.32 cm,生根后根長增長值為1.03 cm。，與模型預測值十分接近，表明由模型預測出的最佳激素組合符合實際操作中人參根誘導的要求，結果比較滿意。

3 討論與結論

均勻設計是方開泰等為了解決多因素、多水平高科技難題而提出的一種試驗設計。基于試驗點在整個試驗范圍內是均勻散布的，從均勻性角度出發(fā)，大大減少了試驗次數(shù)，并且分析準確性好；能從全面試驗點中挑選出部分代表性的試驗點，這些試驗點在試驗范圍內充分均衡分散，但仍能反映體系的主要特征。它與其它試驗設計法的最大不同之處就在于能從盡可能少的試驗次數(shù)中揭示出因素對指標的影響大小和規(guī)律，能夠以最少的次數(shù)，從多個因素中找出影響試驗結果的各因素的主次和最優(yōu)結果，并且可以進行優(yōu)化擬合設計[23]。而本研究是通過均勻設計法優(yōu)化了人參單芽誘導生根的培養(yǎng)基。

由于人參的生長周期長、繁殖系數(shù)少、常異花授粉等生物學特性嚴重制約品種選育進程。因而雖然栽培人參的系統(tǒng)選育工作己經(jīng)開展了幾十年，育種工作者也積極進行了新品種的選育工作，但育成品種卻很少，而組織培養(yǎng)作為一種快速創(chuàng)造新種質的方法，能在較短時間內對品質優(yōu)良的單株進行擴增，因此利用組織培養(yǎng)方法是克服這些不利因素，加快人參新品種選育進程，提高基礎研究水平的有效途徑。然而，至今為止，人參組織培養(yǎng)仍然存在難度大、發(fā)根難、再生植株頻率低等諸多問題。

本研究通過均勻設計篩選出了誘導人參根的最佳培養(yǎng)基為NO3-3 mg/L+NH4+7 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+IBA 8mg/L+6-BA 0.125 mg/L+IAA 0.15 mg/L+GA36 mg/L+8%瓊脂+3%蔗糖，其根的誘導率達95%。本實驗室在前期研究中已篩選出誘導人參愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.66 mg/L+1%瓊脂，誘導率為93%和誘導人參不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+IBA 3 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 3 mg/L+1%瓊脂，誘導率為86%。因此，本實驗室已基本建立了較完整的人參組培體系，對加快人參新品種選育進程，提高人參基礎研究水平等諸方面具有重要意義。