基于ENO基因的豬附紅細胞體病PCR-ELISA檢測方法的建立

相思宇， 倪婷婷， 薛書江

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

豬附紅細胞體病是由豬附紅細胞體(Mycoplasmasuis)引起的一種以貧血、發熱和黃疸為主要臨床癥狀的傳染病[1-2]。豬患病后可分為急性感染和慢性感染2種，該病具有較高的隱性感染率，常和其他疾病混合感染，使該病的臨床診斷難度增加，給我國養殖業造成巨大經濟損失[3-5]。因此，建立一種特異性高、靈敏度強的檢測方法，對豬附紅細胞體病的診斷和防治具有重要意義。

目前，豬附紅細胞體病的診斷方法主要有直接鏡檢法(姬姆薩染色法，瑞氏染色法、丫啶橙染色法、電鏡法)[6-8]、血清學診斷法(ELISA法)[8-10]、分子生物學診斷方法(DNA雜交技術法、PCR技術法、半套式PCR技術法)[11-12]和PCR-ELISA法[13-14]。其中，前3種方法雖然在附紅細胞體病診斷方面得到了大量的應用，但3種方法均易出現假陽性和假陰性結果。而PCR-ELISA方法是一種將PCR擴增與ELISA檢測相結合的技術，由Niemeyer等于1997年創建[15]。PCR-ELISA方法與前幾種方法相比具有更高的敏感性和特異性，該技術不僅提高了檢測結果的準確性和特異性，還有效避免了常規方法中容易錯判的假陽性和假陰性結果。該方法已在病毒、微生物、寄生蟲的檢測以及腫瘤治療等領域被普遍應用[15-17]。如2005年，Scotter等用實時熒光定量PCR法與PCR-ELISA法對侵入性曲霉感染的檢測進行了比較，結果顯示PCR-ELISA較實時熒光定量PCR具有更高的敏感性[18]。

雖然PCR-ELISA方法在寄生蟲早期診斷方面得到了應用，但目前關于豬附紅細胞體病的PCR-ELISA診斷方法較少。該試驗根據GenBank上公布的豬附紅細胞體ENO基因序列設計合成引物，旨在建立適用于豬附紅細胞體病的診斷及流行病學調查的PCR-ELISA檢測方法，從而為豬附紅細胞體病的防治提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

豬血液樣本采自吉林省延吉市某豬場。豬附紅細胞體、豬鏈球菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、弓形蟲以及健康豬血清均由延邊大學預防獸醫實驗室保存。DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶、辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體、TMB顯色液均購自大連寶生物工程有限公司；鏈霉親和素、鮭魚精DNA均購自上海生工生物股份有限公司；血液DNA提取試劑盒及質粒提取試劑盒均購自OMEGA生物公司。

1.2 PCR擴增以及PCR擴增條件的篩選

根據Genbank中豬附紅細胞體 ENO基因(CP002525.1)，用Oligo6.0軟件設計1對引物，并在上、下游引物的5′端分別標記生物素(BIOT)和地高辛(DIG)。(p1)：5′-BIOT-AGGGATACCGCATCAAGACAC-3′;(p2)：5′-DIG-TCATCGGAACCGACGTAAACT-3′。以豬附紅細胞體陽性DNA為模板進行PCR擴增，25 μLPCR反應體系：模板DNA 2 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，ExTaqDNA 聚合酶 0.3 μL，上、下游引物各 1.5 μL，dd H2O 16.2 μL，dNTP 1 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，設置退火溫度梯度從50～60 ℃：50.0 ℃、50.7 ℃、51.9 ℃、53.7 ℃、56.1 ℃、58.0 ℃、59.2 ℃和60.0 ℃，72 ℃ 45 s，共25個循環，72 ℃ 10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據條帶亮度選擇最佳退火溫度。以豬附紅細胞體陽性DNA為模板，選擇15、20、25、30、35個循環，同時選擇10、30、50、100、300倍稀釋PCR產物。測各孔OD630nm值，確定最佳循環數以及PCR產物稀釋倍數。

1.3 PCR-ELISA檢測步驟

將PBS用鏈霉親和素稀釋后，100 μL/孔，4 ℃條件下包被過夜。甩去液體并拍干，用200 μL/孔的PBST洗板，并拍干，重復3次后。加入封閉液200 μL/孔，封閉2 h，洗板拍干后加入PCR產物按1∶30稀釋，100 μL/孔，37 ℃固定1 h。PBST洗板后拍干加入1∶2 000倍稀釋的抗地高辛抗體,37 ℃作用1 h，洗板拍干后加入TMB顯色液100 μL/孔，37 ℃避光放置10 min，用酶標儀測定OD630nm值。

1.4 ELISA反應條件的優化

在相同反應條件下，篩選鏈霉親和素包被液(50 mmol/L pH值9.6碳酸鹽緩沖液、40 mmol/L pH值6.8 Tris-HCL緩沖液以及40 mmol/L pH值8.8 Tris-HCL緩沖液)，選擇碳酸鹽緩沖溶液進行包被，對鏈霉親和素包被濃度(10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL)和HRP標記的抗地高辛抗體稀釋度(1∶1 000～1∶5 000)做方陣滴定。對封閉液魚精DNA濃度(0.25、0.5、1.00、2.00 mg/mL)和封閉時間(30、60、120 min)進行篩選優化，根據以上優化的最佳條件。在37 ℃條件下，選擇顯色液作用10、15、20、25 min時測定各孔OD630nm值。

1.5 PCR-ELISA臨界值的確定

1.6 PCR-ELISA的特異性試驗

對豬附紅細胞體、豬鏈球菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、弓形蟲及健康豬血的DNA，按所建立的PCR-ELISA方法進行檢測，評價其特異性。

1.7 PCR-ELISA敏感性試驗

將豬附紅細胞體陽性DNA基因用去離子水進行梯度稀釋，得到1.77×1011、1.77×1010、1.77×109、1.77×108、1.77×107、1.77×106和1.77×105拷貝/μL的一系列梯度濃度，按照最佳條件進行常規PCR及PCR-ELISA試驗，比較二者敏感性并分析敏感性與DNA濃度的關系。

1.8 PCR-ELISA的重復性試驗

選擇同一批次包被的以及不同批次包被的酶標板，對4份豬附紅細胞體PCR陽性產物進行批內以及批間重復性試驗。每份樣品重復5次測定OD630nm值，計算變異系數，以評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣本檢測

用本試驗所建立的PCR-ELISA方法以及夏曉輝[16]建立的PCR-ELISA方法，對采自延吉市某豬場的40份豬血液樣本進行檢測，以比較二者的敏感性，并計算二者符合率。

1.10 數據分析

利用SPSS軟件進行方差分析，檢測差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增及其擴增條件的篩選結果

以豬附紅細胞體陽性DNA為模板進行PCR擴增，擴增體系與反應條件參照1.2步驟進行。結果得到大小約為170 bp的條帶，與預期ENO基因片段大小相符(圖1)。PCR擴增條件的篩選結果，58 ℃為最佳退火溫度。PCR循環數和稀釋倍數篩選結果顯示，最佳循環數為25，PCR產物的最佳稀釋倍數為1∶30。

注：M.DL 2 000vDNA Marker;1.ENO gene;2.Negative control

2.2 ELISA反應條件的優化

對ELISA反應條件的優化結果顯示，最佳包被液為pH 9.6碳酸鹽緩沖液；鏈酶親和素最適濃度為5 μg/mL；抗地高辛抗體最佳稀釋倍數為1∶2 000；鮭魚精DNA最適濃度為1 mg/mL，封閉時間為37 ℃下反應2 h；最佳顯色時間為15 min。

2.3 PCR-ELISA臨界值的確定

在最佳條件下對30份豬附紅細胞體陰性樣本進行PCR-ELISA檢測。根據SPSS軟件計算得到平均值x=0.138，標準方差SD=0.018，由公式臨界值=平均值+3×標準方差，求得陰性與陽性的判斷標準OD630nm值為0.192。OD630nm≥0.192為陽性，反之則為陰性。

2.4 PCR-ELISA特異性試驗

利用本試驗建立的PCR-ELISA方法對豬附紅細胞體、豬鏈球菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、弓形蟲及健康的豬血基因DNA進行檢測，結果顯示本試驗所建立的方法僅對豬附紅細胞體檢測為陽性，對其他病原體表現為陰性(表1)，表明本試驗具有良好的特異性。

表1 PCR-ELISA特異性試驗

注：“+”為陽性；“-”為陰性。

2.5 PCR-ELISA敏感性檢測

用本試驗建立的PCR-ELISA對濃度分別為33、3.3、0.33 ng/μL和33、3.3、0.33 pg/μL及33 fg/μL的豬附紅細胞體DNA進行檢測。結果顯示PCR-ELISA可檢測出樣本的最低濃度為0.33 pg/μL(表2)，而常規PCR檢測方法可檢測的模板最低濃度為3.3 pg/μL。表明該試驗建立的PCR-ELISA的敏感性較高，且比常規PCR高約10倍。

表2 PCR-ELISA敏感性檢測結果

2.6 PCR-ELISA重復性檢測

批內重復性試驗結果顯示，5份樣品的變異系數為2.59%～6.17%，5份樣本變異系數均低于10%，說明建立的PCR-ELISA1檢測方法的批內重復性良好(表3)。

表3 批內重復性試驗(OD630nm)

批間重復性試驗結果顯示，5份樣品的變異系數為3.45%～7.39%，變異系數均低于10%，說明建立的PCR-ELISA檢測方法批間重復性良好(表4)。

表4 批間重復性試驗(OD630nm)

2.7 臨床樣本檢測

對40份血液樣品應用本試驗所建立的PCR-ELISA方法與夏曉輝建立的PCR-ELISA方法進行對比試驗。結果顯示，本試驗所建立的PCR-ELISA檢測出9份陽性樣品，檢出率為22.5%(9/40)，利用夏曉輝建立的PCR-ELISA方法檢測出7份陽性樣品，檢出率為17.5%(7/40)，結果證明該試驗建立的PCR-ELISA方法陽性檢出率更高，二者的符合率為95%(表5)。

表5 臨床樣本檢測結果

注：PCR-ELISA-1為夏曉輝建立的PCR-ELISA方法；PCR-ELISA-2為本試驗建立的PCR-ELISA方法。

3 討論與結論

豬附紅細胞體病目前沒有較穩定統一的診斷方法，因此，建立一種適合于臨床準確診斷該病的檢測方法，對該病的控制以及預防具有重要意義。國內外學者對豬附紅細胞體的檢測方法進行了大量研究。目前豬附紅細胞體病的檢測主要以傳統檢測方法為主，這些方法易產生假陽性和假陰性的結果，不適用于臨床大批量檢測豬附紅細胞體病。Niemeyer等于1997年創建了PCR-ELISA技術，該方法具有所需試驗儀器要求低、材料低廉、操作簡便、特異性強、敏感性高、不易產生假陽性和假陰性等特點，適合大批量檢測[13]。如2005年，Scotter等用實時熒光定量 PCR法與PCR-ELISA法對侵入性曲霉感染的檢測進行了比較，結果顯示PCR-ELISA較 實時熒光定量 PCR具有更高的敏感性[18]。PCR-ELISA 技術利用逐級放大生物信號，具有敏感、特異的優點。國內外研究表明，PCR-ELISA方法與傳統方法相比較，敏感性提高了10～100倍[19]

2013年，夏曉輝等用豬附紅細胞體OxaA基因成功建立了PCR-ELISA檢測方法，結果顯示建立的PCR-ELISA方法具有敏感、特異、安全和準確性高等特點[14]。而本試驗則選擇2011年GenBank上最新公布的ENO基因建立附紅細胞體的PCR-ELISA檢測方法。ENO作為發現的第3個豬附紅細胞體的特異性基因，其表達蛋白是一種特異性更強的蛋白并具有很好的免疫原性，但目前還未建立該基因的PCR-ELISA診斷方法。因此，本試驗選擇該基因建立PCR-ELISA檢測方法，對于豬附紅細胞體的臨床診斷具有重要意義。

本試驗建立的PCR-ELISA方法與夏曉輝建立的PCR-ELISA方法相比較，優化了豬附紅細胞體PCR-ELISA反應條件，簡化了操作步驟，節省了操作時間，提高了檢測的靈敏度。敏感性檢測結果顯示，本試驗建立方法的檢測濃度為1.77×106拷貝/μL的陽性DNA，與夏曉輝建立的方法檢測最低濃度1.93×106拷貝/μL的陽性DNA比較，本試驗建立的PCR-ELISA方法敏感性更高。對批內及批間的重復性進行檢測，變異系數均低于10%，證明本試驗建立的PCR-ELISA方法具有很好的穩定性。對40份臨床血液進行PCR-ELISA檢測，本試驗方法陽性檢出率為22.5%(9/40)，夏曉輝建立的PCR-ELISA方法陽性檢出率為17.5%(7/40)，且二者的符合率為95%，由此證明，本試驗建立的PCR-ELISA方法對臨床樣本檢測的靈敏度更高。

此外，本試驗建立PCR-ELISA方法的目的主要是在于通過對試驗條件的篩選，建立一種敏感性更高，適合臨床檢測的試驗方法。由于該方法是建立在PCR基礎上，因此對PCR的循環數及PCR產物的濃度進行篩選至關重要[20]。試驗結果證明，在25個循環時檢測結果最好，擴增效率達到了峰值，25個循環后擴增效率進入平臺期，因此確定25循環為最佳的循環數。而PCR產物的濃度則選擇30倍稀釋，原因在于30倍稀釋時的OD值較對照組差異更加明顯，并且高濃度的PCR產物有利于縮短固定時間。

本試驗基于ENO基因所建立的豬附紅細胞體PCR-ELISA檢測方法具有強的敏感性及特異性，易于臨床應用。