不同區域氧濃度在結腸癌細胞上皮間質轉換-間質上皮轉換過程中的作用

雷星，陳熹，趙琳，單濤

作者單位：1延安大學附屬醫院普外科，陜西 延安 716000；2西安交通大學第二附屬醫院普外科，陜西 西安 710004；3第四軍醫大學西京醫院心臟外科，陜西 西安 710032

結腸癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤，它的發病率呈現逐年上升趨勢，重要特征是明顯的轉移傾向，轉移機制的研究能夠為其提供治療新思路［1］。腫瘤的轉移是指腫瘤細胞從原發灶遷移到遠處并形成新病灶的過程。其主要步驟分為［2］：局部侵潤、血管內滲、循環轉運、血管外滲、定植灶形成。這其中可逆的轉變過程上皮間質轉換（EMT）扮演了重要角色［3］。發生EMT的腫瘤細胞在形成轉移灶后，又表現出與原來病灶腫瘤類似的結構［4］。據此Thiery［3］提出腫瘤轉移二階理論，該理論認為腫瘤的侵潤和循環播散需要EMT過程，而循環腫瘤細胞要經過其逆過程間質上皮轉換（MET）來形成轉移灶。可惜的目前EMT-MET時空調控具體機制不明確，無法為腫瘤的治療提供新思路［5］。

生物學實驗中標準的細胞培養條件下，培養細胞所用的氧分壓與空氣氧分壓相同，為160 mmHg，而生物體內的氧分壓卻遠遠低于大氣中氧分壓，例如腦中為24 mmHg，肺中為110 mmHg，肝中為24 mmHg，心臟中為25 mmHg，脾中為66 mmHg，腎中為25 mmHg，微環境缺氧更是實體腫瘤顯著特征［6-7］。高氧或低氧是指細胞可利用氧的增多或減少，或環境氧分壓高于或低于臨界值的狀態。現有的研究說明缺氧通過HIF-1α信號通路介導腫瘤細胞發生EMT并促進轉移；而高壓氧可直接抑制乳腺癌和神經膠質瘤的生長，這提示習慣于低氧環境的腫瘤細胞，腫瘤短時間內無法適應高氧環境，導致其生物學的變化［8］。Apostolou等［9］研究顯示，高壓氧可改變乳腺癌細胞的可塑性，使其由EMT向MET轉變進而降低腫瘤侵襲性。提示氧環境可賦予腫瘤細胞間質上皮可塑性，而這一作用是否可用來解釋腫瘤二次轉移復原機制還未見報道。為此本研究自2016年1月至2017年1月在體外模擬原發灶低氧環境，歸巢部位常氧或適度高氧環境，運用激光共聚焦、熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRTPCR）等方法，觀察不同氧濃度下腫瘤細胞EMT、MET形態變化，探索結腸癌發生轉移機制，為治療研究提供新依據。

1 材料與方法

1.1材料RIPA裂解溶液盒購于碧云天集團。二甲基亞砜（DMSO）購置于美國Sigma集團。DMEM培養溶液和牛胎血清購于美國HyClone集團。Transwell小室購于美國Millpore集團。基質凝膠和One-StepRT-PCR試劑盒購自美國BD集團。鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和肌動蛋白（βactin）抗體購于SantaCruz生物科技集團。

1.2細胞培養及處理人結腸癌細胞COLO205購于美國ATCC細胞庫。細胞培養于含100 ml/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100–g/mL鏈霉素的DMEM培養基。細胞培養到80%融合時給予干預，分為低氧組（氧濃度5%）；常氧組（氧濃度21%）；輕度高氧組（氧濃度30%）。常氧組置于普通CO2培養箱中培養，低氧及高氧組則置于自制培養器皿中（10 cm×15 cm×25 cm），通入含有5%、30%O2或5%CO2的混合氣體。培養2 d后培養基更換為3 mL無血清基礎培養基，置于普通CO2培養箱培養1 d后收集細胞，進行下一步試驗。

1.3免疫熒光細胞培養后常規鋪片，滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS，浸潤已知抗原標本片10 min棄去。滴加適當稀釋的抗體標本，覆蓋已知抗原標本玻片，置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30 min。玻片用0.01 mol/L，pH7.4的PBS沖洗1～2次，然后按順序過0.01 mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5 min，同時給予充分振蕩。用濾紙吸去水分，滴加適當稀釋的熒光標記的抗人球蛋白抗體，蓋搪瓷盒內37℃保溫保持30 min。覆蓋蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4細胞遷移實驗使用劃痕實驗檢測中細胞的遷移能力。24孔板內接種1×105細胞，細胞長至90%時，用無菌槍頭于單層細胞上劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3遍，培養24 h，ImageProPlus5.0觀察及照相。實驗重復3次。

1.5細胞侵襲實驗使用Transwell小室檢測腫瘤細胞的侵襲能力。小室聚碳酸酯膜上鋪100–L 1∶10稀釋并4℃預冷的基質膠（用DMEM稀釋至5 mg/mL），把鋪好膠的小室放入37℃培養箱中孵育4 h使基質膠凝固并在聚碳酸酯膜上形成一層連續的薄膜。正常培養的結腸癌細胞并混勻于含0.1%胎牛血清白蛋白。混勻的細胞均勻種于小室中的上室，500–L含10%胎牛血清的DMEM培養基加入小室中的下室做趨化因子。37℃下培養24 h，聚碳酸酯膜取出，用棉簽輕擦去基質膠及上室的細胞，下室的細胞4%多聚甲醛固定后結晶紫染色。100倍顯微鏡下計數5個隨機視野內的細胞總數，實驗重復3次。

1.6逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）用TRIzol試劑提取COLO205細胞總RNA。2 μg RNA用RevertAidkit合成第一條cDNA鏈。PCR引物設計：E-cadherin上游引物：5′-CAATGGTGTCCATGTGAACA-3′，下游引物：5′-CCTCCTACCCTCCTGTTCG-3′；vimentin上游引物：5′-CGCTTCGCCAACTACAT-3′，下游引物：5′-AGGGCATCCACTTCACAG-3′；βactin上游引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下 游 引 物 ：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。PCR反應條件：首先94℃變性3min，再進行 35個以下循環：94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃35 s。最終72℃5 min。管家基因β-actin用作內參照。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外光下觀察。

1.7統計學方法每個實驗重復3次以上。SPSS13.0進行統計學分析，采用one-wayANOVA方差分析法分析數據，首先利用Levene方法進行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統計學意義后進一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同氧濃度下結腸癌EMT、MET變化為了檢測低氧是否對腫瘤細胞發生EMT具有促進作用，我們利用光鏡觀察癌細胞形態顯示：低氧干預后結腸癌細胞形態明顯由圓形變成紡錘形或長梭形，排列方式較雜亂、無方向性，放射狀外觀（圖1）。激光共聚焦檢測實驗評估COLO205細胞熒光強度。結果顯示：低氧組結腸癌細胞Vimentin熒光強度高于常氧組和高氧組，而E-cadherin熒光強度低于常氧/高氧組（圖1）。提示低氧能夠增強結腸癌細胞EMT變化，而常氧/高氧可反轉EMT向MET轉化。

圖1 不同氧濃度下結腸癌EMT、MET變化（×400）

圖2 不同氧濃度下結腸癌細胞的遷移能力變化（×200）：A為低氧組；B為常氧組；C為高氧組

2.2氧濃度對結腸癌細胞的遷移能力影響為了明確低氧是否通過誘導結腸癌細胞發生EMT轉變來增強結腸癌細胞的遷移，我們使用劃痕實驗檢測低氧對結腸癌細胞遷移能力的影響。細胞處理48 h后，常氧/高氧誘導的COLO205細胞較低氧組顯示出減弱的遷移能力（圖2）。這說明低氧誘導結腸癌細胞發生EMT轉變后，可以相應地增強腫瘤細胞遷移能力，而常氧/高氧反轉EMT后相應地降低其遷移能力。

2.3氧濃度對結腸癌細胞的侵襲能力影響我們利用transwell實驗檢測來研究低氧誘導結腸癌細胞發生EMT轉變后是否對結腸癌細胞的侵襲的能力有影響。其結果顯示，低氧組細胞穿過薄膜的數目較常氧/高氧組明顯增多（圖3）。提示低氧誘導結腸癌細胞發生EMT可以相應增強腫瘤細胞侵襲能力，而常氧/高氧反轉EMT相應降低其侵襲能力。

圖3 不同氧濃度下結腸癌細胞的侵襲能力變化（×200）：A為低氧組；B為常氧組；C為高氧組

3 討論

EMT在腫瘤轉移中提高細胞遷移及侵襲能力，助其突破基膜，并促進血管內滲幫助其進入循環，形成 CTCs［10-11］。腫瘤細胞發生 EMT，不但促進CTCs產生，還可幫助CTCs存活，為CTCs通過MET形成腫瘤轉移灶打下基礎［12］。目前EMT-MET時空調控的確切機制尚不明確。在此研究中我們證實腫瘤原發處低氧微環境可調控細胞EMT發生，上調Vimentin表達，下調E-cadherin表達，并且增強侵襲能力，而常氧/高氧環境下則發生相反的現象。此結果證實我們的假說，即已習慣乏營養環境下生存的腫瘤細胞進入歸巢富氧微環境后，失去低氧誘導，迫使腫瘤細胞發生EMT-MET轉換，形成新的轉移灶，一旦腫瘤在空間上生長到一定體積后，又建立新的乏氧微環境，再次形成新的惡性循環，以此方式不停的促進腫瘤進展。

實體腫瘤局部微環境最顯著的特點是缺氧。已經證實結腸癌中存在明顯的缺氧狀態，其缺氧程度甚至比其他實體腫瘤更嚴重。這種缺氧環境與腫瘤侵襲特征密切相關［13］。低氧的腫瘤微環境下腫瘤細胞的生物學行為更趨向惡性，更具侵襲性，并治療的表現強抵抗性。在缺氧可以影響腫瘤細胞的上皮間質可塑性，誘導EMT發生［14］。Cano等［15］通過體內外實驗證實缺氧通過HIF-1α上調Slug的表達，誘導EMT從而增強腫瘤細胞侵襲轉移能力。我們的研究結果和上述結果一致，也再次證實了此結論。在此基礎上本次試驗繼續在富氧環境下觀察到MET現象，這是本研究閃亮點。提示氧濃度的差異在腫瘤轉移的不同階段，EMT和MET之間轉換具有重要作用。這種原發灶低氧環境和歸巢部位富氧環境的差異有可能是EMT-MET轉換的新視角。更深入的機制研究仍需進一步驗證。

在腫瘤轉移播散的過程中，EMT可賦予腫瘤細胞新特性，這主要包括增加細胞遷移和侵襲能力，使其突破基膜，并通過促進血管內滲幫助腫瘤細胞播散進入循環，形成CTCs。Thiery［16］等發生EMT的細胞與未發生EMT的細胞均可以形成腫瘤，但只有前者侵入相鄰組織和血管，提示癌細胞發生EMT是產生CTCs的必要條件。播散到遠處CTCs適應周圍基質環境后，還會再經歷一個MET轉換，重新獲得增殖特性，進而形成腫瘤轉移灶［17］。目前研究這種可逆并且瞬時的EMT-MET轉換將是一個重要科研方向。作為一個新的研究領域，無疑有大量未知問題亟待解決。顯然，深入研究CTCs-EMT產生和轉化的機制及其生物學意義必將有助于揭開腫瘤發生、發展和轉移之謎，并且可為制定新的腫瘤靶向治療策略提供依據。

總之，上皮腫瘤細胞需要經過一個動態EMT/MET過程才能形成微轉移，這其中微環境氧濃度的差異發揮作用，針對EMT逆轉過程可能成為阻止腫瘤細胞復發的新途徑。在不久的將來，加強我們對于腫瘤轉移過程中EMT/MET動態過程分子調控的理解可以為我們提供更有效的手段去根除腫瘤轉移。（本文圖1～3見插圖9-2）