促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用

趙德福 張輝 楊文海

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

我國腦血管病的發(fā)病率和死亡率都位居第一位，而腦血管病患者中約70%為缺血性腦血管病，后者主要的一個(gè)病理損傷就是缺血再灌注損傷〔1〕。在缺血再灌注損傷這一病理過程中，有多種發(fā)病機(jī)制參與其中，如細(xì)胞外基質(zhì)的破壞、鈣超載、炎癥反應(yīng)〔2〕等，這其中起到重要作用的是細(xì)胞外基質(zhì)的破壞〔3〕。據(jù)報(bào)道有細(xì)胞外基質(zhì)破壞作用的物質(zhì)之一就是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9〔4〕，而轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1能起到修復(fù)組織損傷的功能〔5〕。本實(shí)驗(yàn)，擬在腦缺血再灌注模型大鼠中以促紅細(xì)胞生成素(EPO)為干預(yù)手段，以TGF-β1和MMP-9為實(shí)驗(yàn)觀測指標(biāo)，探索EPO在腦缺血再灌注模型大鼠細(xì)胞外基質(zhì)損傷與修復(fù)過程中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1儀器 160x連續(xù)變倍體式顯微鏡(桂林儀器廠)；CIAS-1000圖像分析儀(北京大恒圖像視覺有限公司)；LEICA-RM2135石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司)。

1.2試藥 EPO(成都地奧制藥廠)；TGF-β1一抗及MMP-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3動(dòng)物 由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，90只健康SD大鼠，雄性，大鼠體重240～260 g，許可證號(hào)：SCXK(遼)2003-2007。

1.4大鼠分組與給藥 大鼠被隨機(jī)分為5組(每組18只)：假手術(shù)組、缺血再灌注組和EPO低、中、高劑量(1 000 U/kg、3 000 U/kg、5 000 U/kg，中劑量EPO取人臨床應(yīng)用劑量標(biāo)準(zhǔn))組，術(shù)前EPO 3個(gè)劑量組分別給予規(guī)定劑量的EPO腹腔注射連續(xù)3 d，每天1次，在相同條件下，缺血再灌注組和假手術(shù)組分別給予腹腔注射等量的生理鹽水。

1.5模型制備方法 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型采用線栓法〔6〕。所有大鼠術(shù)前禁食禁水6 h，腹腔注射水合氯醛(濃度為3 ml/kg)麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，頸中略偏左切開皮膚，找到頸總動(dòng)脈并手術(shù)分離，從其近心端用頸動(dòng)脈夾夾住，手術(shù)剪于頸總動(dòng)脈剪一切口，動(dòng)脈插管插入，順動(dòng)脈導(dǎo)管插入已處理的魚線，經(jīng)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈到大腦中動(dòng)脈，以充分阻斷大腦中動(dòng)脈的血流，然后插管撤出，皮膚縫合，魚線于血流中斷2 h撤出，血流再灌注，持續(xù)時(shí)間12 h，判定缺血再灌注模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)為神經(jīng)功能評(píng)分〔6〕為1～3分。

1.62，3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察各組大鼠腦梗死體積 上述處理后，每組抽取大鼠6只，斷頭處死后留取腦組織，并將腦組織置于溫度為-20℃的冰箱中持續(xù)20 min，沿腦組織的冠狀面將其制成厚度為0.2 mm的腦片，將其浸入到濃度為2% 的TTC溶液，溫度為37℃的水浴持續(xù)30 min。將采集來的圖像，應(yīng)用圖像處理軟件做相應(yīng)處理，腦梗死體積計(jì)算方式采用文獻(xiàn)〔7〕的方法計(jì)算。

1.7免疫組化法觀察TGF-β1、MMP-9的表達(dá) 每組取6只大鼠，烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，斷頭后分離海馬組織，多聚甲醛(濃度4%)固定，制備厚度約5 μm的切片，切片予脫蠟、洗滌，過氧化氫(H2O2，濃度3%)處理，用濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min，滴加TGF-β1或MMP-9一抗，孵育過夜(溫度控制4℃)，PBS洗滌3次，每次5 min，予滴加二抗，37℃孵育30 min，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，干燥，鏡下觀察。

1.8Western印跡檢測TGF-β1、MMP-9蛋白的表達(dá) 取剩余6只大鼠，麻醉斷頭取海馬組織，剪碎，加入裂解液，離心機(jī)離心，留取上清液，制備組織蛋白樣品；測定蛋白含量；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃度10%)；將組織蛋白轉(zhuǎn)移至正電荷尼龍膜上；封閉雜交；試劑盒顯色；分別分析TGF-β1蛋白和MMP-9蛋白的表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分 假手術(shù)組神經(jīng)功能正常；缺血再灌注組與假手術(shù)組相比，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，評(píng)分升高(P<0.01)；EPO 3個(gè)劑量組神經(jīng)功能與缺血再灌注組相比，評(píng)分明顯降低(P<0.01)；與EPO低劑量組相比，EPO中、高劑量組神經(jīng)功能障礙程度顯著減輕，評(píng)分顯著下降(P<0.05)；而EPO中劑量組神經(jīng)功能與EPO高劑量組相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2TTC染色結(jié)果 假手術(shù)組腦組織顏色紅潤，無梗死；缺血再灌注組和EPO 3個(gè)劑量組梗死區(qū)腦組織腫脹，顏色蒼白，進(jìn)一步計(jì)算腦梗死體積，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組顯著高于EPO 3個(gè)劑量組(P<0.01)；與EPO低劑量組比較，EPO中、高劑量組腦梗死體積進(jìn)一步減小(P<0.05)；但EPO中劑量組與EPO高劑量組間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及腦梗死體積比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與缺血再灌注組比較：2)P<0.01；與EPO低劑量組比較：3)P<0.05；下表同

2.3免疫組化染色結(jié)果 觀察大鼠海馬組織CA1區(qū)，正常時(shí)MMP-9和TGF-β1主要存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，蛋白表達(dá)量少，被外界刺激因素激活后TGF-β1迅速從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。TGF-β1、MMP-9在假手術(shù)組細(xì)胞內(nèi)極少表達(dá)。缺血再灌注組胞核內(nèi)TGF-β1及胞質(zhì)內(nèi)MMP-9較假手術(shù)組表達(dá)明顯增多(P<0.01)。與缺血再灌注組相比，EPO 3個(gè)劑量組胞核內(nèi)TGF-β1表達(dá)明顯增多，胞質(zhì)內(nèi)MMP-9的表達(dá)明顯減少(P<0.01)，且EPO中、高劑量組TGF-β1、MMP-9的變化較EPO低劑量組更明顯(P<0.05)。但EPO中、高劑量組間TGF-β1、MMP-9的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 各組TGF-β1、MMP-9免疫組化染色結(jié)果(×400)

表2 免疫組化檢測各組大鼠TGF-β1 和MMP-9的表達(dá)

2.4Western印跡法檢測結(jié)果 TGF-β1和MMP-9蛋白在假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)幾乎不表達(dá)。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組TGF-β1、MMP-9的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與缺血再灌注組相比，EPO 3個(gè)劑量組TGF-β1表達(dá)明顯增多，MPP-9的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，與EPO低劑量組相比，EPO中、高劑量組TGF-β1和MPP-9表達(dá)量變化更加顯著(P<0.05)；EPO中、高劑量組間TGF-β1和MMP-9的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 Western印跡檢測各組TGF-β1 和MMP-9蛋白表達(dá)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是腦梗死發(fā)病及治療過程中的一個(gè)非常重要的病理生理過程〔8〕。腦梗死后缺血再灌注損傷的病理機(jī)制多種多樣，細(xì)胞外基質(zhì)的破壞在此過程中扮演了重要角色。

降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要物質(zhì)之一是MMP-9，MMP-9在正常腦組織細(xì)胞很少表達(dá)，當(dāng)腦缺血再灌注時(shí)，腦組織細(xì)胞內(nèi)MMP-9〔9〕表達(dá)明顯增多，MMP-9將會(huì)降解Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等細(xì)胞基底膜的成分，結(jié)果是腦內(nèi)血管通透性增加，腦血腦屏障受到破壞。與MMP-9破壞細(xì)胞外基質(zhì)功能相對(duì)應(yīng)的是，TGF-β1具有組織損傷修復(fù)的功能〔10〕。TGF-β1的存在曾被看作是神經(jīng)元存活的重要標(biāo)志，其具有多種生理功能，包括促進(jìn)細(xì)胞生長分化、抑制炎癥及促進(jìn)組織修復(fù)等。TGF-β1在腦缺血過程中的作用近年來被逐漸重視〔11〕，腦損傷時(shí)TGF-β1的表達(dá)對(duì)腦損傷的保護(hù)和修復(fù)極其關(guān)鍵〔12〕。

EPO是臨床中各種貧血治療中的一線用藥。其在神經(jīng)保護(hù)方面的作用是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，結(jié)果不一，Jantzie等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn) EPO對(duì)腦損傷具有修復(fù)作用，也有研究發(fā)現(xiàn)EPO具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)功〔14〕，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制目前尚不十分明確。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌注組在缺血再灌注12 h后較假手術(shù)組神經(jīng)功能障礙明顯，腦梗死體積增大，海馬組織TGF-β1及MMP-9的表達(dá)升高；EPO各劑量組與缺血再灌注組比較，大鼠神經(jīng)功能缺損減輕，腦梗死體積減小，海馬區(qū)TGF-β1的表達(dá)增加，MMP-9的表達(dá)下降，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大鼠腦缺血再灌注損傷的過程中MMP-9發(fā)揮了重要作用，而 在這一過程中，TGF-β1對(duì)腦損害起到保護(hù)功能。實(shí)驗(yàn)還表明，腦缺血再灌注過程中，EPO可以使MMP-9的表達(dá)減少，TGF-β1的表達(dá)增多，起到神經(jīng)保護(hù)作用。EPO的劑量不同，其發(fā)揮作用的程度也不同，與EPO低劑量組相比，EPO中、高劑量組效果更明顯，EPO中、高劑量組間效果無明顯差異。在效果相同的情況下，EPO作為促進(jìn)紅細(xì)胞生成藥物，高劑量組其副作用可能也會(huì)較大，因此，中劑量EPO其發(fā)揮腦保護(hù)作用可能最佳。