高表達抗PD-1單克隆抗體細胞株工藝開發的研究

張勇，覃鴻妮，謝鈺珍，王倩文

（1.蘇州工業園區服務外包職業學院，江蘇蘇州 215123；2.蘇州智享眾創孵化管理有限公司，江蘇蘇州 215123）

程序性死亡受體1（Programmed death 1，PD-1）是一種重要的免疫抑制分子，屬于免疫球蛋白超家族[1]。PD-1主要在激活的T細胞和B細胞中表達，功能是抑制細胞的激活，這是免疫系統的一種正常的自穩機制，因為過度的T/B細胞激活會引起自身免疫病，所以PD-1是人體的一道護身符[2-4]。但是，腫瘤微環境會誘導浸潤的T細胞高表達PD-1分子，腫瘤細胞會高表達PD-1的配體PD-L1和PD-L2，導致腫瘤微環境中PD-1通路持續激活，T細胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細胞[5-7]。PD-1的抗體可以阻斷這一通路，部分恢復T細胞的功能，使這些細胞能夠繼續殺傷腫瘤細胞。以PD-1為靶點的免疫調節對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意義。其配體PD-L1也可作為靶點，相應的抗體也可以起到相同的作用[2]。本研究以PD-1分子為靶點，以中國倉鼠卵巢（CHO）細胞為宿主，構建高表達抗PD-1單克隆抗體的細胞株，優化細胞株篩選工藝，得到穩定高表達PD-1細胞株，且蛋白質量與原研藥一致。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

重組工程細胞株的構建，采用自Invitrogen購入的FreedomTMCHO-STM kit。該試劑盒包含表達載體pFreedomTM CHO1.0和宿主細胞CHO-S。細胞生長過程中使用化學限定培養基CD FortiCHO 培養基，呈懸浮態生長。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的合成

根據信號肽氨基酸序列得出目的基因序列，設計引物通過PCR方法合成目的基因。

（1）目的信號肽序列及引物序列。

Heavy chain METDTLLLWVLLLWVPGSTG（信號肽）

Light chain METDTLLLWVLLLWVPGSTG（信號肽）

（2）擴增引物序列。

重鏈 01-H-F：5’-CTTCCTAGGGCCACCATGGGCTG GAGCCTGATCCT-3’

01-H-R：5’-attGTATACTCACTTGCCCAGGGAGAG GCTCA-3’

輕鏈 01-L-F：5’-CTTGATATCGCCACCATGGATTTT CAGGTGCAAAT-3’

01-L-R：5’-ATTTTAATTAATCAGCATTCGCCCCGA TTAAAGGACTTGG-3’

1.2.2 表達質粒的構建

由Primer軟件設計2對特異性引物（本實驗所有引物均由蘇州金維智生物科技有限公司合成），引物經過1輪PCR擴增，得到H鏈目的片段，將H鏈目的片段通過T4連接的方法克隆到經過AvrII和BstZ17I雙酶切過的 Freedom ?pCHO 1.0載體上，命名為pCHO1.0-H。引物經過第2輪PCR擴增，得到L鏈目的片段，將L鏈目的片段通過T4連接的方法克隆到經過EcoRV 和PacI雙酶切過的pCHO1.0-H載體上，命名為pCHO1.0-PD-1。

1.2.3 重組工程細胞株的構建

電轉染的方法將抗體表達質粒pCHO1.0-PD-1轉入宿主細胞，利用Puromycin和MTX篩選系統對細胞進行加壓篩選和克隆化，從而得到高表達PD-1抗體的克隆。通過比較克隆的生長特征及所表達蛋白的性質，最終確定細胞株。重組工程細胞株的構建采用自Invitrogen購入的FreedomTMCHO-STM kit，將轉染48小時后的細胞懸液過濾后傳代至T75方瓶。所用篩選培養基分別為含有 10 μg/ml Puro、100 nmol/L MTX。將方瓶置于37℃，8% CO2的培養箱中靜置培養。7天后開始每3～4天檢測細胞活率，當細胞活率大于30%或細胞活率較最近一次檢測有所增加時，將細胞以1×106個/ml的密度傳代至125 ml搖瓶。當細胞活率大于85%，細胞密度大于1×106個/ml時，第一階段篩選完成。對第一階段加壓放大得到的3個細胞群和第二階段加壓放大得到的3個細胞群采用6孔板5天靜止培養的方法進行高產細胞群的篩選。6孔板5天靜止培養方法：以0.3×106個/ml的細胞密度接種至6孔板，接種體積為3 ml，第5天結束，收獲上清液。利用生物膜干涉技術檢測抗體表達量，篩選出抗體表達量最高的細胞群。

1.2.4 細胞株的鑒定

對表達量最高的2個克隆進行基因組目的基因測序及支原體、無菌檢測。并對2個克隆所表達抗體進行理化性質分析。

1.2.4.1 目的基因測序

用 TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒、按照廠家提供的方法，分別提取初步穩定性實驗中連續傳代至第9代的細胞的基因組DNA，以基因組DNA作為模板，用表中位于目的基因側翼區的引物進行PCR，分別獲得攜帶全長IBI308重鏈基因及輕鏈基因的PCR產物。將PCR產物進行DNA測序。

1.2.4.2 支原體檢測及無菌檢測

使用支原體PCR檢測試劑盒，對2個細胞株進行初步支原體檢測。檢測方法詳見試劑盒說明書。若待測樣品存在支原體污染，檢測結果應獲得290 bp的PCR條帶。

1.2.4.3 LC/MS法產品分子量檢測

切糖樣品處理：樣品用 New England Biolabs公司的 PNGase F（P0704S）切糖，取 50 μg樣品用超純水稀釋至90 μL，加入10×G7緩沖液（隨酶提供）10 μL、PNGase F 2 μL，37 ℃孵育 24 h。孵育后的樣品轉移至離心濃縮柱中，以13 000 r/min速度離心15 min，再以 1 000×g的速度回收蛋白 3 min 后加 8 mol/L 的鹽酸胍 100 μL 和 1 mol/L DTT 3 μL，37 ℃孵育1 h以還原二硫鍵。然后脫鹽并稀釋至1 mg/mL，上LC-MS分析。處理的樣品采用LC-MS檢測。

不切糖輕重鏈分子量檢測樣品處理：取樣品50 μg至離心濃縮柱中，加水至 500 μL，以 13 000 r/min速度離心 15 min，再以 1 000×g的速度回收蛋白3 min 后加 8 mol/L 的鹽酸胍 100 μL 和 1 mol/L DTT 3 μL，37 ℃孵育1 h以還原二硫鍵。然后脫鹽并稀釋至 1 mg/mL，上 LC-MS 分析。

1.2.4.4 蛋白SEC純度（SEC-HPLC法）

用超純水將樣品稀釋至2 mg/mL，置于進樣瓶中，接上分析柱，設置方法參數為：流速0.5 mL/min，柱溫 25 ℃，進樣量 50 μL，即蛋白 100 μg，每個樣品重復進樣2次，檢測波長280 nm，分析時間30 min。檢測完成后，采用峰面積歸一化法計算各樣品主成分的百分比。

1.2.4.5 初步傳代穩定性檢測

復蘇原始細胞株進行初步傳代穩定性研究。將復蘇后細胞連續培養59天（約60個細胞世代）。傳代過程中使用添加1% Anti-Clumping Agent、1 000 nmol/L MTX的生長培養基，接種密度為0.3×106～ 0.8×106個 /mL，接種體積為 30 mL。每周一、三、五傳代。觀察傳代過程中2個細胞株的細胞密度、細胞活率和倍增時間。

1.2.4.6 抗體表達量檢測

2個原始細胞株連續傳代約60世代后，分別對M0（原始細胞）、M1（連續傳代一個月）、M2（連續傳代兩個月）的細胞進行14天流加培養實驗，檢測蛋白表達量。

2 結果與分析

2.1 抗體表達質粒pCHO1.0-PD-1的構建

采 用AvrII/BstZ17I和EcoRV/PacI對 質 粒pCHO1.0-PD-1進行酶切鑒定，確認酶切位點及質粒片段大小正確。如圖1所示，用AvrII/BstZ17I進行雙酶切，目的片段大小為 1 400 bp，用 EcoRV/PacI進行雙酶切，目的片段大小為750 bp，目的片段大小正確，所以酶切位點及質粒片段大小正確。對最終表達質粒pCHO1.0-PD-1進行目的基因測序分析，對比結果顯示與理論序列一致。

圖1 Lbcpf1片段PCR擴增電泳圖

2.2 高表達PD-1的重組工程細胞株構建

2.2.1 篩選高表達細胞群

對第一階段加壓放大得到的3個細胞群和第二階段加壓放大得到的3個細胞群采用6孔板5天靜止培養，收獲上清液，利用生物膜干涉技術檢測抗體表達量。結果表明：以1（第二輪加壓）、2（第二輪加壓）二個細胞群抗體表達量較高，分別為20.3 mg/L、25.5 mg/L。

2.2.2 篩選陽性單克隆

利用有限稀釋法對表達量最高的細胞群18（10/100～50/1000）進行單克隆篩選，在培養第20天時用利用生物膜干涉技術檢測上清內的抗體表達量，表達量最高的分別為19.38 mg/L和18.27 mg/L，最低的為5.76 mg/L。篩選出表達量最高的48個克隆，24孔板培養5天后，最高的表達量分別為19.14 mg/L和 17.75 mg/ L，最低的為 10.72 mg/L。篩選出表達量最高的24個克隆，6孔板培養5天后，將表達量高的前18個克隆擴增培養，進行14天流加培養實驗，檢測其中的蛋白量，結果如圖2，從圖中可以看出克隆01C90和01C42的表達量是最高的兩個，分別為2 091 mg/L 和 2 028 mg/L。

表1 細胞群靜止表達量

圖2 14天流加培養蛋白量

2.3 細胞庫的鑒定

2.3.1 支原體檢測及無菌檢測

如圖3所示，樣品1和樣品2在290 bp處無條帶出現，而3號陽性對照在290 bp處有明顯的條帶，所以支原體檢測結果為陰性。用濾膜過濾法檢測細胞庫，無菌檢測結果為陰性。

圖3 支原體檢測

2.3.2 LC/MS法產品分子量檢測

采用LC-MS法測定了克隆01C42和01C90的切糖輕重鏈分子量和不切糖輕重鏈分子量。檢測結果表明：兩個克隆的實測分子量無明顯差異，均為23 745.0，與理論分子量差異在方法誤差范圍內。重鏈未切糖實測分子量無明顯差異，均為507 166.2，與含有G0F糖型的理論分子量差異在方法誤差范圍內，重鏈切糖實測分子量48 270.9，與理論分子量差異在方法誤差范圍內。因此認為兩個克隆的輕重鏈分子量相同，且與理論值一致。

2.3.3 蛋白SEC純度（SEC-HPLC法）

原始細胞庫2個原始細胞株所表達抗體的SEC檢測結果，結果顯示，經Protein A親和柱純化后，2個原始細胞株所表達的抗體的SEC純度均高于98%。說明這2個原始細胞株在抗體SEC純度上均表現優異。

2.3.4 初步傳代穩定性

將復蘇后細胞連續培養59天（約60個細胞世代）。60個世代的初步傳代過程中2個克隆01C42和01C90的抗體表達量均未降低，倍增時間維持在20～30 h，細胞活率均高于95%。

2個原始細胞株連續傳代約60世代后，分別對M0（原始細胞）、M1（連續傳代一個月）、M2（連續傳代兩個月）的細胞進行14天流加實驗檢測蛋白表達量。表2所示為不同世代的2個細胞株14天累積的抗體表達量。圖4為不同世代的2個細胞株在14天流加培養實驗中的抗體表達量。

表2 不同世代的原始細胞株抗體表達量

圖4 不同世代的原始細胞株抗體表達量

3 討論與結論

3.1 討論

運用懸浮細胞CHO表達抗PD-1的抗體，無論從表達上還是穩定性都有著比較強的優勢，首先在質粒構建中，將重鏈和輕鏈插到同一個載體上，保證了重鏈和輕鏈的比例為1∶1，可以實現共表達，輕重鏈在一個載體上，再同PD-1基因共轉染，對后面的基因擴增篩選提供基礎。采用懸浮培養，使用化學成分確定的培養基CD培養基化學成分簡單，制備方便，能很好的支持重組CHO細胞的生長，進而可以達到高密度培養，可達8×106～10×106vc/mL，批次培養的總細胞密度可達 100×106～ 150×106vc/mL，高密度的生長優勢促使細胞粉筆的產量達到一個較高的水平，單純的批次培養最高表達產量可達1g/L，為后續的工藝降低生產成本，減少下游工藝開發的復雜性，另外懸浮培養對于大規模生產有很大優勢，如可連續擴大生產量，有利于細胞與培養基中的營養物質和氣體充分接觸，而且易于控制培養條件（溫度、pH、氧氣分壓和二氧化碳等），培養條件穩定，趨于均一，便于進行定量研究，于在連續密封的系統中進行，減少了操作步驟和污染的機會，可以長期連續培養，既可節省人力，又使細胞能持續維持在對數生長期。單克隆抗體是特異性很強的藥物，如果可以很好的解決免疫原性的問題，它應用于腫瘤或其他疾病應比其他藥物的副作用低得多。從長遠來看，作為治療用品，有著廣闊的前景，從商業的角度來講，治療性抗體的市場也將是巨大的，隨著基因組學和蛋白組學的發展，越來越多的基因及其相關蛋白的發掘，與腫瘤和其他疾病相關的抗原就成為了治療性抗體研究的主要靶標，治療性單抗將在人類疾病治療中扮演重要角色[8-10]。

3.2 結論

通過構建表達質粒PD-1、細胞轉染、加壓篩選、有限稀釋獲得高表達PD-1抗體的單克隆。14天流加培養抗體表達量最高的2個克隆01C42和01C90抗體表達量為2.03 g/L和2.09 g/L。2個亞克隆所攜帶的目的基因序列與理論序列完全相同，所表達抗體的分子量與理論分子量一致。經protein A親和柱純化后的抗體純度均高于98%，60個世代的初步傳代過程中2個克隆的抗體表達量均未降低，倍增時間維持在20～30 h，細胞活率均高于98%。