飼料中添加肉桂醛和芽孢桿菌對半滑舌鰨腸道結構的影響

蔣溥，王競儒，劉桐，謝體彪，朱鵬錦，王慶奎，王洋

（天津農學院水產學院 天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）因生長速度快、肉質滑嫩、味道鮮美而深受消費者喜愛。目前，半滑舌鰨的養殖以工廠化循環水養殖為主，但因養殖密度大、生態不平衡，魚體抗病力低，極易發生病害。肉桂醛（3-苯基丙稀醛）具有防腐殺菌[1-2]、抗炎[3]、抗癌[4]等作用，作為抗生素替代物，已廣泛應用于畜禽養殖[5]。近年來，肉桂醛在水產飼料中的應用也取得了理想效果。前期研究發現飼料中添加肉桂醛能顯著提高半滑舌鰨的免疫力和抗病能力，然而肉桂醛在抑制病原微生物的同時[6]，也會降低益生菌的數量[7]，因此可能影響水產動物的腸道菌群平衡。為此，團隊前期從益生芽孢桿菌中篩選出一株高產水解酶，且對低濃度肉桂醛具有一定抗性的益生菌，可與肉桂醛聯合應用與水產養殖。芽孢桿菌能夠顯著提高水產動物對飼料中碳水化合物[8]、蛋白質和脂肪[9]的利用率，水產品生長性能[10]，并改善水產動物的腸道結構[11]。在前期研究中，團隊通過養殖試驗證明了芽孢桿菌與肉桂醛聯合使用能顯著提高半滑舌鰨的生長性能和飼料利用率。然而，二者共同使用時對腸道結構的影響還未闡明。

基于此，本研究考察肉桂醛和芽孢桿菌聯合投喂半滑舌鰨60天后對半滑舌鰨腸道結構的影響，為芽孢桿菌與肉桂醛在水產養殖中的聯合應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 半滑舌鰨的養殖與分組

60尾體表無傷、體質健壯、規格差別較小的半滑舌鰨被隨機分為4組，每組3個重復，每個重復5尾魚。試驗用魚飼養在容積為300 L的圓形玻璃鋼水槽中。每日投喂 2 次（07：30、17：30），微流水養殖且每天換水2次，每日換水量為水體總體積的1/2，投飼率為1%，根據魚體增重情況進行適量調整。養殖水溫保持（23.7±0.5）℃，pH值7.89±0.12，養殖水體氨氮含量維持在（0.05±0.03）mg/L，亞硝酸鹽含量維持在（0.02±0.02）mg/L，溶氧含量為（6.23±0.48）mg/L，鹽度16.26±1.88，24 h連續充氣，以此方法養殖約3個月，養殖的前7天為暫養期，以進一步排除病魚及其他異常魚，且讓試驗魚適應養殖條件和養殖管理策略。隨后各組魚以相應飼料飼喂馴化至各組魚攝食達到體重的1%后開始正式養殖試驗。正式養殖試驗周期為60天。

1.2 飼料配制及成分測定

四組飼料中基本成分完全一致（配方詳見表1），僅肉桂醛和益生菌含量有差別，如表2所示，空白對照組-P1組投喂不含肉桂醛（含空白包埋物）的顆粒料，P2、P3和P4組為試驗組，P2組飼料在制備過程中添加了1 000 mg/kg環糊精-肉桂醛包合物。P3組投喂不含肉桂醛（含空白包埋物）的顆粒料，在投喂飼料前以生理鹽水溶解菌粉，拌于飼料中，使得益生菌的濃度約為 1×107CFU/g。P4 組飼喂添加 1 000 mg/kg環糊精-肉桂醛包合物的飼料，并在飼喂前噴灑益生菌。

表1 飼料配方組成

表2 試驗飼料四種處理

飼料營養成分：粗蛋白51.67%、粗脂肪14.30%、粗灰分9.36%、水分7.90%、鈣2.69%、磷0.28%。

飼料中粗蛋白含量采用杜馬斯灼燒法（GB/T 24318-2009）；粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T 50096-2010）；粗灰分含量采用550 ℃高溫灼燒法（GB/T 50094-2010）；水分含量測定采用 105 ℃常壓恒溫烘干法（GB/T 50093-2010）；鈣含量采用高錳酸鉀法（GB/T 6436-2002）；磷含量采用分光光度法（GB/T 64375-2010）。

1.3 樣本采集

各組半滑舌鰨飼喂不同飼料60天后，取樣前禁食24 h，從每組的隨機撈取9尾（每缸3尾）半滑舌鰨，以間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（商品名為MS-222）以及低溫冰水麻醉試驗魚。在冰浴條件下解剖取半滑舌鰨腸道，在1%甲醛溶液中固定待用。

1.4 腸道切片的制備與觀察

制作前腸組織石蠟切片，以HE染色，以麥克奧迪MoticBA600Mot全自動顯微鏡掃描，觀察腸道絨毛高度、絨毛厚度、絨毛分支、絨毛末端膨大情況，上皮內淋巴細胞以及固有層炎癥浸潤情況。

1.5 數據統計與分析

切片采用麥克奧迪數字切片助理1.0軟件采集量化數據并生成圖片，數據采用Excel對試驗數據進行常規處理后，使用SPSS17.0軟件對數據進行統計分析，運用多重比較法進行組間差異顯著性分析，顯著水平為0.05。本試驗所有數據用平均值±標準差表示，每個數據包含50根絨毛的信息。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌和肉桂醛改善前腸絨毛結構

飼喂普通飼料的對照組半滑舌鰨前腸橫切片清晰地展示了前腸的漿膜（Se）、肌層（MC）、黏膜下層（Su）（見圖1-A）。對照組小腸絨毛的小腸絨毛高度較高、密度大，少數絨毛末端膨大。另外有少數絨毛很短。絨毛表層有排列整齊的柱狀上皮細胞，外部紋狀緣染成紅色，其核位于細胞基部，接近固有膜（圖1-A）。與對照組相比，飼料中含肉桂醛的P2組小腸絨毛末端膨大比例更高（圖1-D），分布于上皮細胞中間的杯狀細胞在部分絨毛中密度增加（圖1-F），但整體平均密度并無統計差異（P＞0.05）（表1）。有研究發現，適當濃度的肉桂醛能顯著提高肉雞十二指腸、空腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度，優化腸道結構，促進肉雞腸道形態結構的發育[12]。本研究中雖未發現半滑舌鰨前腸絨毛高度的改變，卻檢測到絨毛末端的結構變化。這種結構變化可能有利于提高前腸對飼料中成分的消化吸收能力。飼喂芽孢桿菌的P3組，前腸絨毛出現末端分支（圖1-G），局部增厚（圖1-H），且絨毛中央乳糜管寬度增加（圖1-I）。同時飼喂肉桂醛和芽孢桿菌的P4組，小腸絨毛密度顯著增加。腸絨毛高度以及寬度的增加有利于提高魚體消化吸收能力。許多研究發現益生菌可以改善虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）腸道結構[13]。飼喂芽孢桿菌可以改善中國白對蝦（Fenneropenaeus chinensis）中腸的結構[14]。飼喂凝結芽孢桿菌可以增加太平洋白蝦（Litopenaeus vannamei）腸道的絨毛高度、寬度和腸道肌層厚度[15]。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）也可以增加太平洋白蝦的腸道上皮高度[16]，腸道絨毛的數量和高度[17]。除了益生菌外，一些益生元（可促進某些益生菌生長）也能改善魚類腸道結構。如甘露寡糖可以改善金頭鯛（Sparus aurata）的腸道結構[18]。各類低聚糖可以改善紅鼓（Sciaenops ocellatus）的腸道結構，增加了腸道褶皺高度[19]。除了增進營養物質的吸收，腸道結構的改善還有利于增強魚體對病原細菌的抵御能力[20]。關于脊椎動物的研究表明，腸道固有層的增厚和腸道免疫水平的提高以及腸道結構的成熟密切相關[21]，這種結構改變更有利于抵抗微生物的入侵[22]。

圖1 各處理組半滑舌鰨前腸切片圖（放大倍數400）

2.2 芽孢桿菌和肉桂醛刺激腸道免疫

飼喂芽孢桿菌的半滑舌鰨前腸淋巴細胞分布不像對照組一樣全部沿基層分布，而有少數聚集在黏膜下層呈輕微炎性浸潤（圖1-K），或者遷移到上皮細胞之間（圖1-L）。Fronte等發現飼料中蛋白源改變所引起的金頭鯛（Sparus aurata）腸道絨毛的增厚和分支與輕微的上皮內淋巴細胞以及固有層中的炎性浸潤共同出現[23]。因此少量淋巴細胞分布于上皮細胞間或者黏膜下層，可能有利于提高免疫水平，而不是炎癥的表現。

2.3 芽孢桿菌和肉桂醛影響杯狀細胞密度

從統計數據可知（表3），無論肉桂醛、芽孢桿菌還是其復合使用，均顯著降低了前腸肌層厚度。雖然各處理組對絨毛形態有一定影響，但各組的絨毛高度和寬度平均值并無顯著差異。肉桂醛和芽孢桿菌單獨處理并沒有影響絨毛表層杯狀細胞的密度，但是二者聯用顯著降低了杯狀細胞的密度（P＜0.05）。據報道，魚類腸道杯狀細胞的功能與研究較為透徹哺乳動物并不相同。南方鯰腸道杯狀細胞的主要分泌物為酸性黏多糖[24]，保護上皮細胞免受消化酶的破壞，還可對堅硬食物起到潤滑作用。肉桂醛與芽孢桿菌共同使用時降低了前腸絨毛杯狀細胞的密度，可能會影響前腸黏液的分泌。杯狀細胞分泌的黏液對于腸道微生物而言是一道重要的抵御屏障，肉桂醛處理后造成的杯狀細胞密度降低，很有可能增強腸道對微生物的通透性。不過肉桂醛本身較強抑菌作用可以在一定程度上降低魚類通過腸道感染病原微生物的風險。另外，肉桂醛處理后絨毛寬度的增加也能增強對病原微生物的抵御力。

3 結論

肉桂醛與芽孢桿菌單獨使用或者聯合使用均能顯著改善半滑舌鰨的前腸結構。增加腸絨毛分支以及寬度，擴大乳糜管空間，有利于營養物質的吸收以及對病原微生物的抵抗。促進淋巴細胞遷移至上皮細胞間，或者在黏膜下層，提高魚體的免疫水平。二者聯用效果更為明顯，不過芽孢桿菌和肉桂醛聯用降低了前腸杯狀細胞密度，可能在一定程度上影響腸道黏液分泌和自身對外界病原微生物的抵抗作用。

表3 肉桂醛和芽孢桿菌對半滑舌鰨前腸的影響